[发明专利]利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用

权利要求书

1.利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其特征在于其基因序列为SEQ ID No.1。

2.利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

A、克隆分子伴侣基因DnaK

以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行PCR反应，上游引物DnaK-F：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcagtgagtaaagttatcggaat-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；下游引物DnaK-R：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；

PCR反应体系为20μL：DNA mix 10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，DMSO 0.8μL，灭菌水8.2μL；

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳；

B、PCR产物回收及纯化

采用NEB公司DNA Gel Extract ion Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤A中的方法中进行电泳，然后切胶；

C、中性蛋白酶基因的克隆

C1、质粒酶切和新重组质粒的构建

对pHT43-npr质粒进行BamHI和SmaI双酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和DnaK片段为模板，设计特定引物进行PCR反应，得到npr+DnaK片段；最后采用Gibson连接方法将pHT43片段和npr+DnaK片段进行连接，得到新的重组质粒；pHT43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB800N/pHT43-npr CGMCCNo.11625；上游引物npr-DnaK-F：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为BamHI酶切位点；下游引物npr-DnaK-R:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttattttttgttttggtcgtc-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；

C2、大肠杆菌T1转化；

C3、菌液PCR初步鉴定；

C4、重组质粒DNA测序及检验实验的正确性。

3.根据权利要求2所述的利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于所述的步骤B中反应步骤及条件为：

B1、将步骤A制备的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的Binding Buffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化；

B2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；

B3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；

B4、向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；

B5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；

B6、向空吸附柱中加入30μL超纯水,室温静置5min，12000rpm离心3min；

B7、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液；

B8、取步骤B7中的水溶液3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。