[发明专利]一种CYP2C9和/或VKORC1基因多态性快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒含有下列组分：热启动taq DNA聚合酶、血液直接PCR缓冲液(10X)、引物对、探针对和UNG酶；简单、高效、安全：可对血液样本直接进行荧光PCR扩增，无需经过核酸提取和纯化等步骤，降低模板交叉污染的风险，避免了苯酚等有害试剂的使用；灵敏度高：可准确检出低至2μl血液样本，所需样本量少，特异性好：针对CYP2C9C430T、CYP2C9A1075C和VKORC1G‑1639A设计特异的引物和分型探针，可特异性扩增识别对应的多态性。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CYP2C9和/或VKORC1基因多态性快速检测试剂盒。

背景技术

华法林(Warfarin)是新一代抗凝剂，通过竞争性对抗维生素K的作用，抑制肝细胞中凝血因子的合成，降低凝血酶诱导的血小板凝集反应，从而具有抗凝和抗血小板凝集功能。

华法林作为第一个口服抗凝药，已被临床广泛用于多种疾病抗凝治疗，但是华法林的药理作用易受多种因素影响，个体差异大，治疗窗窄，半数有效量与半数致死量的INR水平仅仅相差1倍左右，即使很小的剂量变化可能导致出血等不良反应，因而剂量调整十分重要。临床研究证明CYP2C9和VKORC1基因多态性导致35～50％的患者对华法林反应存在个体差异，这类人群需要更低的起始剂量。2007年8月，美国FDA批准更新华法林的产品说明书，要求在警示信息中标明服用者的遗传差异将影响其对该药物的反应，同时提醒医生如果患者存在这两个基因的变异，在处方华法林时应该采用较低的初始剂量。因此，检测患者这两个基因的多态性情况能科学指导华法林的临床使用。

人细胞色素酶P450(CYP2C9)是华法林的主要代谢酶，其常见等位基因型CYP2C9*2(C430T)、CYP2C9*3(A1075C)会导致该酶的活性下降，从而使药物活性成分在血液中停留时间延长。而维生素K环氧化物还原酶亚单位1(VKORC1)是华法林的主要作用靶点，其SNP位点G-1639A、C1173T和G3739A变异会显著增加患者对华法林的敏感性。其中G-1639A是目前研究的主要位点，在亚洲人群的分布频率约为7.59％。

目前，针对CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的方法有多种，主要包括DNA测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、基因芯片法(Genechips)、液相芯片法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法成本少、通量高，但操作耗时长且灵敏度低，不适合临床快速检测；高分辨率熔解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难。而传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确分型；此外，血液样本通常需经过提取和纯化，获得核酸作为荧光定量PCR扩增模板，虽然提纯的核酸纯度较高，但繁琐的提纯步骤不仅可能造成样本间交叉污染，同时也容易导致核酸的损失，从而增加后续荧光定量PCR失败的风险。因此需要建立一种快速有效且可用于直接检测少量血液样本的CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于血液直接检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，旨在解决现有技术对于血液进行荧光定量PCR扩增时，需要预先对血液进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且增加交叉污染以及有毒试剂使用的问题，此外，还具有扩增效率和灵敏度高、特异性好的优点。

实现上述目的的技术方案如下：

一种检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒含有下列组分：热启动taq DNA聚合酶、血液直接PCR缓冲液(10X)、引物对、探针对和UNG酶；