[发明专利]一种检测辣椒脉斑驳病毒专用引物及其检测方法

权利要求书

1.一种检测辣椒脉斑驳病毒的专用引物，其特征在于，所述引物的序列具体为：

上游引物：ChiVMV-CP-F：如SEQ ID NO.1 所示，即，5’- GCACCATACATTTCAGAAACAGC-3’，

下游引物：ChiVMV-CP-R：如SEQ ID NO.2 所示，即，5’- GAACCACACTGAAGAATATGRATG-3’，

所述的引物PCR扩增的产物如SEQ ID NO.3所示。

2.一种检测辣椒脉斑驳病毒方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）提取待检测龙葵和番茄样品的总RNA，备用；总RNA的提取方法如下：

采用TRIzol法对植物病叶的总RNA进行提取，实验步骤按照说明书进行：

称量花叶重症样品，于液态氮气中研磨至完全粉碎，转移Eppendorf管中；

立即加入TRIzol，室温放置以裂解细胞；离心15 min；

取上清液，加入等体积三氯甲烷混合旋涡振荡，室温下静置；离心15 min；

取上清液，加入体积异丙醇，混合均匀冷藏；离心15 min；

弃上清，用无水乙醇洗涤沉淀；离心15 min；

弃上清，室温干燥，加入RNase-free H₂O溶解，冰上备用，-80℃冻存；

（2）依据TIANScript RT Kit cDNA第一条链合成试剂盒进行反转录；以cDNA为模板进行PCR扩增；

混合均匀，42℃温浴，反应结束后于95℃下温浴以终止反应，待温度降至室温后加入RNase-Free ddH₂O稀释备用；

其中，PCR引物如权利要求1所示；

PCR扩增时采用25μL体系，体系设计如下：

cDNA，3μl；

上游引物，1μl；

下游引物，1μl；

dNTP，1μl；

10*Taq Buffer，2.5μl；

Taq，0.2μl；

补灭菌水至25μl；

反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸40s，实验进行40个循环，72℃终延伸7min；

（3）对（2）中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性条带，目的条带大小为1,103bp，经测序后进行Blast比对，表明样品中含有辣椒脉斑驳病毒；

（4）为进一步确定样品是否受到辣椒脉斑驳病毒侵染，将（3）中待检测PCR 产物样品进行回收，回收产物直接与PMD20-T载体进行连接，转化到DH-5α菌株中培养，挑取单菌落进行菌液复苏，并对复苏后的菌液进行菌液PCR初步鉴定，对阳性菌株进行进一步测序，依据测序结果进行比对，进一步确定样品是否被辣椒脉斑驳病毒侵染。

3.根据权利要求2所述的一种检测辣椒脉斑驳病毒方法，其特征在于，

cDNA第一条链合成的体系如下：

2μl M4-T18；

2μl Super Pure dNTPs，其浓度为2.5mmol；

3μl RNA；

补RNase-Free ddH₂O至14.5μl；

4μl 5×First-Strand buffer；

0.5μl RNase抑制剂，其浓度为20 U•μL^-1；

1μl TIANScript M-MLV反转录酶，其浓度为200U•L^-1。