[发明专利]一种磷酸化肽段和蛋白质富集方法和应用

说明书

本发明涉及一种能在中性缓冲溶液中特异性识别磷酸化肽段和蛋白质的方法功能分子及应用：通过N‑叔丁氧羰基‑L‑酪氨酸与N,N′‑二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子。将磷酸识别功能分子与羧基化的金刚烷铵共价结合，得到具有富集基团的客体分子。将葫芦脲共价修饰于硅球表面，得到主体分子功能化材料。最后利用主体材料在溶液中捕获客体分子来实现磷酸化肽段和蛋白质的富集。该新型磷酸识别功能分子能够在中性缓冲体系下实现对N‑磷酸化肽段和蛋白质的液相识别与固相分离。

技术领域

本发明涉及一种能在中性缓冲溶液中特异性识别磷酸化肽段和蛋白质的功能分子，以及利用主-客体作用将功能分子捕获从而实现对磷酸化肽段和蛋白质富集的策略。

背景技术

蛋白质的翻译后修饰往往调节了生命体的各项生理活动，其中蛋白质磷酸化修饰是最常见的翻译后修饰之一，它涉及体内多种调节过程，包括代谢，转录，翻译，蛋白质降解，体内平衡，细胞信号传导，增殖，分化和细胞存活等(Nat.Biotechnol,2005,23,94-101)。按照发生的氨基酸不同，磷酸化修饰分为O-磷酸化修饰(丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化)、N-磷酸化修饰(组氨酸磷酸化、赖氨酸磷酸化和精氨酸磷酸化)、S-磷酸化修饰(半胱氨酸磷酸化)，以及羧基磷酸化(天冬氨酸磷酸化和谷氨酸磷酸化)。其中，O-磷酸化修饰是研究最多的，其P-O键在强酸条件下具有很好的稳定性，因此很容易利用金属氧化物亲和层析(MOAC)和固定金属离子亲和层析(IMAC)进行富集(Nat Protoc,2013,8,461-480)。然而，目前对于N-磷酸化修饰和S-磷酸化修饰的研究则非常不足，主要原因是由于P-N在酸性条件下不稳定，而S-P键在酸性和碱性条件下均不稳定，导致无法用传统的富集策略实现特异性富集。因此，发展中性条件下富集N-磷酸化肽段或蛋白质的方法具有非常重要的科学意义。

含有空轨道的金属离子可以与磷酸基团中的氧原子产生配位作用，而且不取决于体系pH，因此这些金属离子可以在中性条件下实现对磷酸基团的特异性识别。具有疏水空腔的主体葫芦脲(CB[n]，n＝5-10)的两个羰基环状入口能够结合客体二茂铁甲基铵(FA)或金刚烷铵离子，具有特别高的结合常数(10^-12M^-1)，在水溶液中具有良好的相互识别功能。因此可以利用这种相互对溶液中的磷酸化肽段或蛋白进行有特异性富集。

发明内容

本发明涉及一种能在中性缓冲溶液中特异性识别磷酸化肽段和蛋白质的功能分子，以及利用主-客体作用将功能分子捕获从而实现对磷酸化肽段和蛋白质富集的策略。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子。将磷酸识别功能分子与金刚烷铵结合，得到具有富集基团的客体分子。将葫芦脲修饰于硅球表面，得到主体分子功能化材料。最后利用主体材料在溶液中捕获客体分子来实现磷酸化肽段和蛋白质的富集。具体操作步骤如下：

1.金刚烷铵的羧基化，步骤如下：

(1)羧基化反应：将0.1-10当量1-金刚烷胺，简称为：AD1，0.1-10当量3-溴丙酸和0.1-10当量K₂CO₃悬浮于10-20体积份乙腈中，混合物回流6-12h。

(2)后处理：将反应混合物经硅藻土过滤，并用乙腈充分洗涤。将滤液浓缩，残余物通过色谱柱，二氯甲烷与甲醇为流动相，进行纯化，蒸干得到无色固体，简称为：AD1-APPA。

2.一种磷酸识别功能分子：通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺在多聚甲醛的存在下反应生成保护的前体分子，简称为：Boc-dpa，Boc-dpa去保护后得到功能分子，简称为：dpa。步骤如下：

(1)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺在多聚甲醛的存在下反应生成保护的前体分子，简称为：Boc-dpa：