[发明专利]一种磷酸化肽段和蛋白质富集方法和应用

权利要求书

1.一种在中性条件下富集磷酸化肽段和蛋白质的方法，其特征在于：

(1)在磷酸化肽段和蛋白质标记上磷酸识别功能分子；

(2)利用葫芦脲功能化硅球，富集标记了磷酸识别功能分子的磷酸化肽段和蛋白质；

(3)将磷酸化肽段和蛋白质洗脱，进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法其特征在于：所述磷酸识别功能分子制备方法如下：

(1)采用3-溴丙酸制备羧基化的金刚烷铵；

(2)通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子；

(3)将支撑分子与羧基化的金刚烷铵共价结合，并在其上络合金属离子，形成磷酸识别功能分子得到具有富集基团的功能分子。

3.根据权利要求1所述的方法其特征在于：所述葫芦脲功能化硅球制备方法如下：

(1)葫芦脲的羟基化修饰；

(2)羧基活化的硅球的制备；

(3)将葫芦脲修饰于羧基活化的硅球上，得到葫芦脲功能化硅球。

4.根据权利要求2所述一种在中性条件下富集磷酸化肽段和蛋白质的方法其特征在于：

所述采用3-溴丙酸制备羧基化的金刚烷铵的过程，如下：

(1)羧基化反应：将0.1-10当量1-金刚烷胺，简称为：AD1，0.1-10当量3-溴丙酸和0.1-10当量碳酸钾悬浮于10-20体积份二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、异丙醇、甲醇中的一种以上，混合物回流6-12h；

(2)后处理：将反应混合物经硅藻土过滤，并用乙腈充分洗涤；将滤液浓缩，残余物通过硅胶柱色谱，二氯甲烷与甲醇体积比为9:1为流动相，进行纯化，蒸干得到无色固体，简称为：AD1-APPA。

5.根据权利要求2所述一种在中性条件下富集磷酸化肽段和蛋白质的方法其特征在于：所述支撑分子的制备方法如下：

所述通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子的过程为，通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺在多聚甲醛的存在下反应生成保护的前体分子，简称为：Boc-dpa，Boc-dpa去保护后得到支撑分子，简称为：dpa。

6.根据权利要求5所述的方法其特征在于：Boc-dpa去保护后得到支撑分子的制备方法如下：

所述Boc-dpa的制备过程：

(1)0.1-10当量N,N′-二甲基吡啶胺与0.1-10当量多聚甲醛溶解于20-50％异丙醇溶液中，用盐酸调pH 8.0-9.0，50-90℃反应10-60min；

(2)向上述溶液中加入0.1-10当量N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，100-120℃反应6-24h，得到Boc-dpa；

(3)后处理：将异丙醇蒸干，冷却至室温后收集下层油状物，分散于50体积份乙酸乙酯中，分别用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液清洗，用硫酸钠干燥过夜；以体积比为氯仿：三乙胺：甲醇＝20-50：0.8-1.2：0.1-0.5溶液为流动相，100-300目二氧化硅为固定相纯化产物；

所述的Boc-dpa去保护生成dpa的过程：

将0.1-10当量Boc-dpa分散于1-10体积份二氯甲烷溶液中，滴加10-20体积份三氟乙酸，室温反应1-12h得到dpa。