[发明专利]定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒

权利要求书

1.基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：

正向引物：5'-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3'，

反向引物：5'-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3'，

羊探针：5'-CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT-3'，

牛探针：5'-CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT-3'，

猪探针：5'-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-3'；

羊探针、牛探针和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。

2.基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取肉制品的DNA；

(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；

(3)利用权利要求1所述的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用羊、牛和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；

(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、牛和猪相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性或三源性；

(5)利用羊、牛和猪阳性标准品做DNA定量的标准曲线；

(6)通过将检测肉制品的相应源性的Ct值带入标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。

3.根据权利要求2所述的基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。

4.根据权利要求3所述的基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR mix 10μL，正向引物、反向引物、羊探针、牛探针和猪探针各1μL，DNA1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。

5.含有权利要求1所述的引物和探针的试剂盒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：Probe qPCR mix、权利要求1所述的引物和探针、羊阳性标准品、牛阳性标准品、猪阳性标准品。