[发明专利]基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒，首次开创性地采用了酵母细胞作为遗传背景，将待检测的目的基因，例如人体细胞突变基因，通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中，由此获得的重组酵母细胞可以在针对目的基因的遗传检测中作为阳性对照的标准品。

技术领域

本发明涉及一种基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

在临床的遗传诊断中，基因检测的精确性是十分重要的。以产前检查为例，假阳性的结果会错误的指导患者终止正常的胚胎，假阴性的结果会导致对患病婴儿的乐观预期和错误诊断。在临床上，遗传检测往往是指导形成诊疗方案的基础。越来越多的人利用遗传检测来获得个体在人群中易感几率，从而采取有效的疾病预防措施，包括介入诊疗手段和生活方式的改变等。

为了确保遗传检测结果的可靠性和准确性，每个实验必须具备作为阳性对照和阴性对照的遗传参考物质。

目前较常用的遗传检测标准品有如下几种：

病人样本；

肿瘤组织样本(手术切除/穿刺组织，福尔马林固定/石蜡包埋/冰冻切片/新鲜样本等)血液样本(循环肿瘤细胞、游离的肿瘤细胞基因组)；

含遗传突变的细胞系；

各种遗传病、肿瘤等永生化细胞系；

细胞遗传改造(整合插入、定点突变、基因敲除)；

其他细胞背景的基因敲入；

质粒样品PCR产物：含突变位点及附近序列的重组质粒或PCR产物；

合成DNA样品；

上述各种类型的遗传检测标准品均有其自身的优势和局限性。例如，临床病人样本存在样本获取不便、样品珍贵、均一性不佳、无法大量制备标准品等缺陷；获得遗传病细胞系往往通过病人细胞永生化，且永生化细胞株遗传特性难以长期保持；含肿瘤突变细胞系建株困难且不稳定，含遗传突变细胞系构建过程繁琐，需要复杂的筛选过程同时细胞系价格昂贵，培养条件要求较高；质粒样品构建简单快速，但体系中质粒拷贝数高，稀释和模拟基因组DNA及进行较低突变百分率标准品的混合时会造成很大的误差、易污染。

因此，构建新的基因检测标准品体系是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种基因检测标准品的构建方法，所述构建方法包含将待检测的目的基因序列通过同源重组的方式插入到酵母细胞的基因组中获得含有所述目的基因序列的重组酵母细胞；所述重组酵母细胞在针对所述目的基因的检测中用作阳性对照标准品。

优选的，所述构建方法至少包括构建同源重组模板的步骤，以及将所述同源重组模板转化所述酵母细胞的步骤；所述同源重组模板包含上游同源修复臂和下游同源修复臂，以及位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间的所述目的基因序列；所述同源重组模板中的上游同源修复臂和下游同源修复臂靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因。

优选的，所述构建方法还包括基于基因编辑系统来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤；并且，将所述同源重组模板与所述基因编辑质粒一同转化所述酵母细胞，获得在所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因中插入了所述目的基因序列的重组酵母细胞。

优选的，在所述基于基因编辑系统来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤中：所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述酵母细胞为酿酒酵母，所述营养缺陷型标记基因为URA3基因；其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点；