[发明专利]基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种用于遗传诊断的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：所述构建方法包含将待检测的目的基因序列通过同源重组的方式插入到酵母细胞的基因组中获得含有所述目的基因序列的重组酵母细胞；

所述重组酵母细胞经原生质化处理后，在针对所述目的基因的检测中用作阳性对照标准品；

所述构建方法至少包括构建同源重组模板的步骤，以及将所述同源重组模板转化所述酵母细胞的步骤；

所述同源重组模板包含上游同源修复臂和下游同源修复臂，以及位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间的所述目的基因序列；

所述同源重组模板中的上游同源修复臂和下游同源修复臂靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因；

所述构建方法还包括基于基因编辑系统来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤；并且，

将所述同源重组模板与所述基因编辑质粒一同转化所述酵母细胞，获得在所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因中插入了所述目的基因序列的重组酵母细胞。

2.如权利要求1所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：

在所述基于基因编辑系统来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤中：所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述酵母细胞为酿酒酵母，所述营养缺陷型标记基因为URA3基因；其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点；

在所述构建同源重组模板的步骤中：首先基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建同源重组载体，所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述同源重组载体中、且位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间；最后，再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；

在将获得的所述基因编辑质粒与所述线性化的同源重组模板一同转化酿酒酵母细胞，获得在URA3基因中插入了所述目的基因序列的重组酿酒酵母细胞；

所述构建基因编辑质粒的步骤与所述构建同源重组模板的步骤各自独立完成，不分先后。

3.如权利要求2所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：

在所述构建基因编辑质粒的步骤中，将靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA通过限制性酶切的分子克隆方法连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体中，获得所述基因编辑质粒；

所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示。

4.如权利要求3所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：

在所述构建基因编辑质粒的步骤中，扩增所述gRNA的引物对序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示；所述酵母-大肠杆菌穿梭型载体为p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体；将SapI酶切过的p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体与所述gRNA连接，将获得的连接产物转化大肠杆菌，选取经鉴定的阳性克隆进行扩增培养，经质粒提取和纯化操作获得所述基因编辑质粒。

5.如权利要求3所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：

在所述构建同源重组模板的步骤中，基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的上游序列设计所述上游同源修复臂，基于于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的下游序列设计所述下游同源修复臂。

6.如权利要求5所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：

所述上游同源修复臂的序列如SEQ ID No.5所示；所述下游同源修复臂的序列如SEQID No.6所示。