[发明专利]一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种甜9号种子纯度鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种基于EST‑SSR标记的甜瓜品种“甜9号”杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法以甜瓜品种“甜9号”杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过Gene Bank数据库上公布甜瓜EST序列，利用Primer 3.0在线引物设计，设计EST‑SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。

技术领域

本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及甜瓜杂交种“甜 9号”纯度鉴定方法，是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。

背景技术

“甜9号”是天津科润蔬菜研究所全新培育的厚皮甜瓜新品种，植株长势健壮，耐低温性好，对甜瓜多发病有较强的抗性，坐果性好。果实发育期38天，单果重可达3公斤以上。果皮黄色，果面光洁。果肉浅绿色，肉厚4.5厘米，含糖量16.0％，肉质较脆，香味清香，口感风味俱佳。

甜瓜种子纯度的高低是直接衡量种子质量优劣的主要指标。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。

EST-SSR标记因其具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。近年来，随着测序技术的不断提高和分子生物学的深入研究，大量瓜类作物的EST被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小组共收录西瓜ESTs588789 条，甜瓜129067条，黄瓜513276条。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

本方法通过对供试甜瓜杂交种“甜9号”进行DNA提取、PCR扩增和 EST-SSR分析，确认了杂交种及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对甜瓜杂交种“甜9号”种子进行纯度鉴定。用于鉴定甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度的SSR引物，包括上游引物序列：5’-TTGACCTTTTACGGTGGTCC -3’，下游引物序列：5’-CGGACAAATCCCTCTCTGAA-3’。

本发明所述快速鉴定甜瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室甜瓜品种“甜9号”供试种子的基因组DNA为模板，对已知品种“甜9号”亲本DNA差异性片段进行分析。供试甜瓜杂交种取样及DNA提取方法为：对温室甜瓜随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20 g/LCTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA Na2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA 提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL， Nanodrop ND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

供试甜瓜杂交种PCR方法为：

(1)SSR上游引物序列：5’-TTGACCTTTTACGGTGGTCC-3’，SSR下游引物序列：5’-CGGACAAATCCCTCTCTGAA-3’。