[发明专利]用于检测CEBPA基因突变的引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及用于检测CEBPA基因突变的引物及检测方法。

背景技术

由基因突变导致的细胞增殖、分化和细胞凋亡途径的改变是急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia，AML)的发病基础。近来在正常核型AML中鉴定出了多种有重要预后价值的分子标记，其中髓系转录因子CCAAT增强子结合蛋白-A(CCAAT-enhancerbindingprotein-alpha，CEBPA)在造血系统中只表达于髓系细胞，是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子，具有诱导粒系的分化和抑制增生的作用。在新修订的WHO白血病分类标准中，CEBPA突变的检测已成为AML重要的诊断、分层、预后参考指标，可能成为新的治疗靶点。基因定位于19q13.1，全长3318bp，无内含子，cDNA全长2385bp，内含多个翻译起始位点。其结构包括:N端的转录活性区、DNA结合区和C端的亮氨酸丰富的二聚化功能区。正常情况下以全长42kD蛋白为主，同时存在少量30kD蛋白，二者之间比率的改变将导致其功能的改变。在AML患者中，CEBPA突变率大约为5％-14％,主要见于M1、M2亚型，其中大约70％的突变见于正常核型患者。在良好核型组，如t(15；17)，inv(16)，t(8；21)，尚未见有CEBPA的突变。

近年来，在染色体核型正常的AML患者中已检测出多种体细胞获得性突变，包括mll基因部分串联重复(PTD)、flt3基因内部串联重复(ITD)或酪氨酸激酶结构域(TKD)突变、NPM1、CEBPA、NRAS和WT1等，其中部分突变基因已成为具有评估预后相关性的分子标记物。CEBPA作为一个独立的遗传标志，提示预后良好，已在2010年NCCNAML治疗指南中作为预后指标，用于判断正常核型AML患者的预后情况。

发明内容

本发明目的在于提供用于检测CEBPA基因突变的引物及检测方法，采用本发明提供的引物及检测方法可用于CEBPA基因突变的有效检测，进一步用于判断正常核型AML患者的预后情况，用于检测的准确度、特异性和灵敏度较高。

本发明通过下述技术方案实现：

用于检测CEBPA基因突变的引物，所述引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述试剂盒包括上述的引物。

用于检测CEBPA基因突变的方法，包含以下步骤：

步骤1，取待测样品DNA；

步骤2，采用包括权利要求1所述引物的试剂盒，以步骤1所述的DNA为模板，进行PCR扩增反应；

步骤3，采用PCR扩增产物进行测序反应；

步骤4，测序反应产物经纯化、变性后，上测序仪测序；

步骤5，对测序峰图进行分析，并与CEBPA基因突变类型进行识别。

优选地，所述引物的上游引物和下游引物的浓度均为2.5μL。

优选地，所述PCR扩增反应步骤依次包括：

步骤(1)预变性；步骤(2)变性；步骤(3)退火；步骤(4)延伸；步骤(5)延伸；步骤(6)保存。

优选地，所述步骤(1)预变性温度为95℃，时间为10min。

优选地，所述步骤(2)变性温度为95℃，时间为30s；步骤(3)退火温度为60℃，时间为30s；步骤(4)延伸温度为72℃，时间为1min。

优选地，所述步骤(5)延伸温度为72℃，时间为7min。

优选地，所述步骤3和步骤4采用Sanger测序法检测。

基于上述引物在检测CEBPA基因突变中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明提供了一种用于检测CEBPA基因突变的引物及检测方法，采用本发明提供的引物及检测方法可用于CEBPA基因突变的有效检测，进一步用于判断正常核型AML患者的预后情况，用于检测的准确度、特异性和灵敏度较高。具体地，可用于检测来源于EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样本，通过提取血液样本DNA，扩增CEBPA基因后采用Sanger测序法检测，测序结果采用Sequencher软件进行分析。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明提供的CEBPA-FR2(BZIP)-M13F&CEBPA-FR2(BZIP)-M13R扩增片段。