[发明专利]检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的引物，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.8所示。本发明属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对饮用水中上述四种致病菌的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于检测饮用水标准中的致病菌指标。

技术领域

本发明属于基因工程检测技术领域，尤其涉及检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法。

背景技术

民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱，而饮用水质量安全更是重中之重。近年来，随着疾控预防的研究深入，国家标准、行业标准，各级监抽细则，均明确了饮用水中致病菌的检测指标。当前，针对普通饮用水，该类指标主要包括大肠菌群Coliformbacteria、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，针对饮用矿泉水，该类指标主要包括大肠菌群Coliform bacteria、粪链球菌Enterococcus faecalis、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、产气荚膜梭菌Clostridium perfringens，均要求零检出。

标准方法上，上述致病菌的检测均采用传统培养方法，存在试剂和培养基种类多达十多种、全程基本为手工操作、阴性检测时间至少2d和阳性检测时间可长达5至10d、菌落观察鉴别和生化反应鉴定受人为因素影响较大等情况。随着分子生物学在微生物学中的深入运用，使用PCR技术检测饮用水中致病菌也成为可选方法之一。

第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步。相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。

涉及致病菌检测的PCR技术，已有较广泛的报道，但多为普通PCR方法和单重荧光PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如专利申请200410091917.3《多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法》、200810071105.0《食源性致病菌的检测方法》、201410057135.1《一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法》等。这些专利申请在检测样品和检测对象上与饮用水标准要求相差较大，且存在试剂种类繁多、操作步骤复杂等问题。因此，提供一种适于标准要求和便于操作判定的饮用水中致病菌检测的多重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明对大肠菌群Coliform bacteria、粪链球菌E.faecalis、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、产气荚膜梭菌C.perfringens设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对饮用水中致病菌的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点。