[发明专利]检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法

权利要求书

1.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四对引物：大肠菌群的上游引物为Seq.ID No.1，下游引物为Seq.ID No.2；粪链球菌的上游引物为Seq.ID No.3；下游引物为Seq.ID No.4；铜绿假单胞菌的上游引物为Seq.ID No.5；下游引物为Seq.ID No.6；产气荚膜梭菌的上游引物为Seq.ID No.7；下游引物为Seq.ID No.8。

2.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR探针组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四重荧光PCR探针组：大肠菌群的探针为Seq.IDNo.9，5’端用FAM荧光激发基团修饰；粪链球菌的探针为Seq.ID No.10，5’端用VIC荧光激发基团修饰；铜绿假单胞菌的探针为Seq.ID No.11，5’端用NED荧光激发基团修饰；产气荚膜梭菌的探针为Seq.ID No.12，5’端用Cy5荧光激发基团修饰，所述探针3’端分别用NFQ-MGB荧光淬灭基团修饰。

3.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照。

4.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为用权利要求1所述的引物组进行扩增，并用权利要求2所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为10⁵copies/μL级。

5.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为所述四种致病菌以外的细菌DNA。

6.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/L。

7.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：

①将水样过0.22μm滤膜，洗脱滤膜富集微生物并提取DNA，或将滤膜置于待测致病菌选择培养基增菌后提取DNA；

②建立包括权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2所述的PCR探针组的四重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃ 20s–2min或10–15min；95℃ 5–60s，60℃ 20s–2min；40cycle并收集荧光信号。

8.根据权利要求7所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR方法，其特征在于：所述检测结果的判断包括：

①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行②的致病菌检测；

②结果判定：水样的FAM或/和VIC或/和NED或/和Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的大肠菌群或/和粪链球菌或/和铜绿假单胞菌或/和产气荚膜梭菌；若上述一种或多种荧光无信号及对数增长，且Ct值≥40.0，则不含相应的致病菌；若30.0Ct值40.0时，增加模板量复检，如果Ct值≥40.0，则检测结果为阴性，如果Ct值40.0，则检测结果为阳性。