[发明专利]一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法

说明书

本发明提供了两对PCR引物，该PCR引物退火温度60℃；正反向引物Tm值相差不超过2℃；目的片段长度为867bp和632bp；引物长度19‑21bp；GC含量为40‑60％，碱基呈随机分布态势；同时其特异性良好，PCR产物不形成二级结构，尤其适用于针对CEBPA基因的PCR扩增。此基础上，本发明围绕引物特征基于第一代基因测序技术开发了针对CEBPA基因的检测方法，同时实现对引物性能的验证。该方法对反应体系成分、PCR反应条件进行了全新设计，所得产物通过琼脂糖凝胶电泳验证发现目的基因具有清晰条带，切胶回收后经纯化、测序分析发现，产物确切为CEBPA基因，证明实验结果良好。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及基因检测及PCR引物设计技术，具体涉及一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法。

背景技术

增强结合蛋白α是维持造血系统粒系分化的重要转录因子，在调节细胞增殖与分化的平衡中起着关键的作用。此转录因子含有358个氨基酸，由基因CEBPA编码。基因CEBPA定位于19q 13l，全长3318bp，无内含子，cDNA全长2385bp内含多个翻译起始位点。其结构包括：N-端的转录活性区、DNA结合区、和C-端的亮氨酸丰富的二聚化功能区。正常情况下以全长42KD蛋白为主，同时存在少量30KD蛋白，二者之间比率的改变将导致其功能的改变。第一代基因测序(Sanger法)是检测基因CEBPA的主要方法之一。

Sanger法基因测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种带有荧光标记的终止核苷酸为止，通过捕获荧光来进行分析，最后得到一系列的峰图，分析可得知其序列。

由于CEBPA基因GC含量较高，PCR扩增目的片段容易产生非特异性产物，造成测序质量差，实验过程复杂；且基因序列较长，完全测通所用引物数较多，增多了实验操作次数；所需试剂成本较高。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法，以解决现有技术中利用Sanger法进行CEBPA基因检测时所需引物数量较多的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中由于引物性能不佳而导致CEBPA基因检测方法繁琐。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

作为优选，该PCR引物退火温度为60℃；正反向引物Tm值相差不超过2℃；目的片段长度为867bp和632bp；引物长度19-21bp；GC含量为40-60％。

另一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物组成。

作为优选，该PCR引物退火温度为60℃；正反向引物Tm值相差不超过2℃；目的片段长度为867bp和632bp；引物长度19-21bp；GC含量为40-60％。

一种应用上述PCR引物检测人类基因CEBPA的方法，该方法属于Sanger测序法，其中PCR反应成程序包括以下步骤：95℃预变性3min；95℃变性30s，52～70℃退火30s，72℃延伸70s，32个循环；于72℃最后延伸5min。

作为优选，PCR反应成程序中退火温度为60℃。

作为优选，该方法中目的片段扩增反应体系每20.1μL含有以下成分：GCrackerPCR Buffer 10μL，双蒸水9μL，GCracker PCR Enzyme 0.1μL，10μM的正、反向引物各0.5μL，浓度40～60ng/μL的DNA模板0.5μL。