[发明专利]鸽TTV和鸽新型腺病毒双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供鸽TTV和鸽新型腺病毒双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1‑4所示的引物，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够同时对鸽群中鸽TTV和鸽新型腺病毒感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其溶解曲线峰值（Tm值）即可直接对结果进行判断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明提供鸽TTV和鸽新型腺病毒双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

输血传播病毒，又称Torque teno virus (TTV)，根据国际病毒分类委员会（TheInternational Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）最新分类，将其归类于指环病毒科(Anelloviridae)，α细环病毒属(Alphatorquevirus)。TTV是一类无囊膜、单链环状DNA病毒，研究发现不同种属的TTV病毒基因组长短不一。人源TTV的基因组为3.2kb～3.9kb，猪和犬类的基因组为2.8kb左右，而猫科TTV的基因组约为2.1kb。对TTV的分析发现，TTV基因组有编码区和非编码区组成。一般认为，TTV包含有2个大的开放阅读框（ORFs）：ORF1和ORF2，分别编码复制相关蛋白（Rep）和抗原相关蛋白（Cap）。鸽感染TTV最早于2013年报道（Zhang Z, Zhuang L, Dai W, Mao H, Dai D. Complete genome sequence of a novelpigeon torque teno virus in China. Genome Announc, 2013, 1(6). pii: e01076-13.）。目前，由于鸽TTV无法分离培养，关于鸽TTV致病力、致病机理等相关研究还未见涉及。

腺病毒病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称结构，其基因组为线性双链DNA。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。鸽群感染腺病毒（鸽腺病毒PiAd）最早由Coussement等人于1984年在比利时报道。1995年De Herdt等人发现，鸽群可感染1型和2型腺病毒。2014年Marek 等人（Complete genome sequences of pigeon adenovirus 1and duck adenovirus 2 extend the number of species within the genusAviadenovirus. Virology. 2014, 462-463:107-114.）利用高通量测序技术测定了鸽腺病毒1型（PiAd-1）全基因序列，基因组全长为45480bp，和火鸡腺病毒的基因组结构特征类似。遗传进化分析发现，PiAd-1处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年，Teske等人（Identification of a novel aviadenovirus, designated pigeonadenovirus 2 in domestic pigeons (Columba livia). Virus Res. 2017, 227:15-22.）报道了不同的鸽腺病毒1型（PiAd-1）和腺病毒2型（PiAd-2）的新型鸽腺病毒（PiAd-2variant A和PiAd-2 variant B）（由于GenBank数据库中没有PiAd-2基因序列，作者为了论述严谨，将其命名为PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）。基于Hexon基因的遗传进化分析发现，新型鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）均处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年3月，本研究团队在对1例送检的病死鸽中，利用禽腺病毒的Hexon基因检测到阳性感染（命名为FJ2017株），并利用PCR技术获得其完整的Hexon基因序列（上传GenBank得到其登录号为MF576429）。其核苷酸序列和PiAd-1（GenBank号FN824512）同源性为35.2%、和PiAd-2 variant A（GenBank号KX121164）同源性为34.1%；和PiAd-2 variant B（GenBank号KX164406）（说明，PiAd-2 variant B仅测定682bp的Hexon基因片段序列）同源性为83.9%。上述结果表明，我们获得鸽腺病毒为不同于经典鸽腺病毒（PiAd-1）的鸽新型腺病毒（novel pigeon adenovirus，N-PiAd）。