[发明专利]一种朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的分子鉴定方法。

背景技术

淫羊藿属Epimedium L.植物为多年生草本，是古老原始的双子叶植物类群，在植物系统进化树中处于特殊分类地位，也是我国传统的重要药用植物之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用，且在助孕、抗骨质疏松、提高免疫力和抑制肿瘤等方面具有明显功效。《中国药典》2015年版收录了5种淫羊藿：淫羊藿E.breviconu Maxim.、箭叶淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim.、朝鲜淫羊藿E.koreanum Nakai和巫山淫羊藿E.wushanense T.S.Ying。淫羊藿属植物形态极其相似，大大增加了形态学鉴定的难度。仅仅凭借物种形态上的微小差异来对其进行鉴别易导致鉴别不准确等问题的产生。除药典种外，同属植物粗毛淫羊藿在地方也作为淫羊藿来使用。药材的基原准确是临床准确用药的前提，因此需要一种能对药典种朝鲜淫羊藿及其同属形态近似种粗毛淫羊藿快速准确鉴定的方法。

DNA条形码技术根据物种DNA的差异来完成对物种的鉴定，摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的束缚，不受个体形态、大小等特征和完整性的影响及经验的限制，能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据，操作步骤简便，具有稳定、高效、准确等优点，是传统鉴定方法的有效补充。本发明使用DNA条形码技术，能够实现对朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿进行快速准确鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供利用叶绿体psbA-trnH片段鉴别朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的方法。

具体包括以下步骤：取朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿新鲜叶片，在基因组DNA提取前，用75％的乙醇擦拭表面。

本发明提供的朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的鉴定方法，包括PCR扩增叶绿体psbA-trnH序列。具体包括如下步骤：

1)提取待测样品DNA；

2)PCR扩增含有叶绿体psbA-trnH序列的片段；

3)对扩增产物进行双向测序，拼接，去除引物，获得完整叶绿体psbA-trnH序列。

本发明所用扩增引物序列为：

正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；

反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

所述PCR扩增的体系为每25μL：

2×Taq PCR Mix 12.5μL，2.5μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL(约30ng)，ddH₂O 8.5μL。

所述PCR扩增的条件为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环。

4)基于K2P模型，构建测序拼接后的psbA-trnH序列的系统发育树。

与传统的形态学鉴定、理化鉴定等方法相比，本发明操作简单，结果准确，所获得的psbA-trnH序列有助于实现朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的快速鉴定，缩短鉴定时间。

附图说明

图1所示为朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的种间变异位点图；

图2所示为基于psbA-trnH序列构建的朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的邻接(NJ)树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.从贵州省、四川省和重庆市收集粗毛淫羊藿原植物5份；从吉林省不同地区收集朝鲜淫羊藿原植物2份。详细信息见表1：

表1朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿样品信息表