[发明专利]快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法

权利要求书

1.一种快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)临床呼吸道样本采集和选取

咽拭子样本采用一次性咽拭子刷取鼻咽部上皮细胞，洗脱于1.0ml样本保存液中备用，共收集临床样本若干份；

(2)人腺病毒核酸提取与纯化

采用商品化磁珠法咽拭子核酸提取试剂盒提取和纯化所有样本人腺病毒核酸，所有操作严格按说明书进行；

(3)人腺病毒核酸筛查

采用两种商品化人腺病毒核酸检测试剂盒筛查所有样本人腺病毒核酸，所有操作和结果判断严格按说明书进行；

(4)质控/内标质粒构建

用软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；

(5)B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记

从数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，用软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针；

(6)4重qPCR体系优化、扩增及结果判断

优化4重qPCR反应体系，化学修饰热启动DNA聚合酶，加无菌双蒸水；qPCR扩增两步法，选择FAM、VIC、ROX、CY5，4通道于退火阶段探测荧光，以扩增曲线呈“S”形，CT值≤35，扩增曲线与基线夹角≥30°判为阳性，否则判为阴性；

(7)PCR产物测序：人腺病毒核酸筛查阳性的PCR产物采用克隆测序，PCR产物测序采用上下游引物双向测序；

(8)检测下限与定量范围试验

取2、3、4型人腺病毒培养液提取病毒核酸，用数字PCR系统定量后，将病毒核酸调成约1.0×108Copies/ml，10倍连续稀释成7个梯度浓度，按步骤(6)所述方法和标准上机扩增45个循环，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以扩增效率在0.95～1.05、相关系数>0.98、截距在3.1～3.5的最大与最小稀释度作为定量范围；

(9)真阳性、假阳性、真阴性、假阴性判断

真阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；假阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；真阴性：①本方法及人腺病毒核酸筛查均阴性；②本方法阴性，人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；假阴性：人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；

(10)试剂指标计算：

灵敏度计算：灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性)×100％；

特异性计算：特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性)×100％；

漏诊率计算：漏诊率＝(1-灵敏度)×100％；

误诊率计算：误诊率＝(1-特异性)×100％；

符合率计算：符合率＝(真阳性数+真阴性数)÷检测总数×100％。