[发明专利]一种猪细小病毒口服疫苗组合物及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述猪细小病毒口服疫苗组合物包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：

a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的猪细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；

b)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；

其中，所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；所述重组表达载体编码所述猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。

3.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。

4.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

6.根据权利要求5所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述特定营养基因为URA3基因。

7.根据权利要求5所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10621。

8.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括

1)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)、编码取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有猪细小病毒VP2蛋白活性的氨基酸、且由SEQ ID No.1所衍生的核苷酸序列。

9.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料至少包括淀粉。

10.根据权利要求1-7和9中任一项所述的猪细小病毒口服疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、将编码猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

步骤2、用所述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

步骤3、使所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达所述猪细小病毒VP2蛋白，所述猪细小病毒VP2蛋白在酵母细胞内自组装成猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤4、分离纯化获得所述猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以所述猪细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到所述猪细小病毒口服疫苗组合物。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1还包括所述编码猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸的密码子优化步骤，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，制备得到的所述猪细小病毒口服疫苗组合物口服免疫小鼠的平均滴度到达3000以上，峰值达到6400以上。