[发明专利]阳性血培养物的鉴定芯片、试剂盒及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种阳性血培养物的鉴定芯片、试剂盒及鉴定方法。

背景技术

当前全球卫生领域血流感染的发生率依然很高，而血流感染也仍然是导致患者死亡的主要原因之一。鉴于感染进展迅速和所致后果严重，实时监测对于血流感染的研究尤为重要。到目前为止，血培养依旧是判断血流感染最基础和最重要的实验方法。血培养阳性后通常需要花费2天的时间来鉴定血流感染病原体，其中1天用于病原体的转种培养，另外1天则用于病原体的鉴定和药敏检测。由于不同病原体对药物的敏感性存在较大差异，故病原体的鉴定对于血流感染的研究十分关键。如果能够在更短的时间内鉴定出病原体，那么就能够为临床治疗争取更多的干预时间和成功机会。

目前有一些方法可用于阳性血培养物的快速鉴定，例如探针杂交、实时PCR、MALDI-TOF方法等，这些方法都具备各自不同的优势，但也都存在一些不足之处。比如，探针杂交技术操作较为繁琐，而且敏感性较低；实时PCR需PCR仪，而且成本较高；MALDI-TOF方法需特殊设备，而且敏感性和准确性不高。因此，研发一种快速、简便、准确和成本较低的阳性血培养物鉴定方法及试剂盒已成为众多科研人员的共同心愿。

发明内容

基于此，针对上述技术问题，有必要提供一种快速、简便、准确和成本较低的阳性血培养物的鉴定芯片、试剂盒及鉴定方法。

一种阳性血培养物的鉴定芯片，所述鉴定芯片具有多个反应室，包括阳性质控室、阴性质控室和细菌鉴定室；所述细菌鉴定室包括肺炎链球菌鉴定室、粪肠球菌鉴定室、鲍曼不动杆菌鉴定室、铜绿假单胞菌鉴定室、肺炎克雷伯菌鉴定室、大肠埃希菌鉴定室、金黄色葡萄球菌鉴定室以及流感嗜血杆菌鉴定室中的至少一种，所述细菌鉴定室及所述阳性质控室内均固定有等温扩增引物，其中，

所述粪肠球菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:1～SEQ ID No:6所示的多条引物的组合；

所述金黄色葡萄球菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:7～SEQ ID No:12所示的多条引物的组合；

所述大肠埃希菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:13～SEQ ID No:18所示的多条引物的组合；

所述铜绿假单胞菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:19～SEQ ID No:24所示的多条引物的组合；

所述肺炎链球菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:25～SEQ ID No:29所示的多条引物的组合；

所述肺炎克雷伯菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:30～SEQ ID No:34所示的多条引物的组合；

所述鲍曼不动杆菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:35～SEQ ID No:40所示的多条引物的组合；

所述流感嗜血杆菌鉴定室内固定有序列分别如SEQ ID No:41～SEQ ID No:45所示的多条引物的组合；

所述阳性质控室内固定有序列分别如SEQ ID No:46～SEQ ID No:49所示的多条引物的组合。

在其中一个实施例中，所述细菌鉴定室包括肺炎链球菌鉴定室、粪肠球菌鉴定室、鲍曼不动杆菌鉴定室、铜绿假单胞菌鉴定室、肺炎克雷伯菌鉴定室、大肠埃希菌鉴定室、金黄色葡萄球菌鉴定室以及流感嗜血杆菌鉴定室共八种。一种阳性血培养物的鉴定试剂盒，包括上述任一实施例所述的阳性血培养物的鉴定芯片。

在其中一个实施例中，所述阳性血培养物的鉴定试剂盒还包括DNA提取试剂、LAMP反应试剂、Bst DNA聚合酶、显色液、荧光染料以及去核酸水中的至少一种试剂。

所述LAMP反应试剂包括反应缓冲液、dNTP、MgSO₄和甜菜碱。

所述LAMP反应试剂中含添加有阳性质控DNA片段，所述阳性质控DNA片段是序列如SEQ ID No:50所示的斑马鱼ccna1基因的部分基因片段。

所述显色液为羟基萘酚蓝(HNB)溶液；所述荧光染料为SYBR green。

一种阳性血培养物的鉴定方法，包括如下步骤：

提取阳性血培养物的DNA；

以提取的DNA作为模板，将其与LAMP反应试剂混合后加入上述任一实施例所述的阳性血培养物的鉴定芯片的细菌鉴定室内，并在所述鉴定芯片的阳性质控室和阴性质控室内加入相应的试剂；

在等温条件下进行核酸扩增反应，观察所述鉴定芯片的各反应室的颜色或荧光变化。