[发明专利]一种抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体地说，涉及一种抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种绿色、安全的益生菌饲料添加剂，该类饲料添加剂在增强动物机体免疫力、改善肠道微生物平衡等方面发挥着重要的作用。鸡干扰素(ChIFN)是一类具有高效、广谱抗病毒作用的动物细胞因子，是治疗和预防鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊和减蛋综合征等多种禽类传染性病毒病的重要药物。

目前，国内外对禽类干扰素的生产主要是通过基因工程技术生产并纯化制备成注射液加以应用，存在生产成本高和易出现应激等缺陷，从而限制了禽类干扰素在养殖业中的广泛应用。对不需纯化并直接口服利用的家禽干扰素转基因益生工程菌研究具有重要意义，是保障绿色畜牧业发展的重要途径。但是转基因活性工程菌由于可能存在潜在的生态安全等隐患，而受到我国在内的世界各国相关转基因安全管理法规的约束，因此难以直接应用于禽类养殖。

发明内容

有鉴于此，本申请针对上述的问题，提供了一种抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，得到一种安全的抗病毒活性酵母工程菌，它对鸡新城疫等病毒具有抑制作用，可以作为益生菌抗病毒饲料添加剂应用，以改变现有禽类干扰素的利用方式，降低干扰素的利用成本。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，包括以下步骤：

1)工程菌株的遗传稳定性鉴定：

利用SC选择培养基对工程菌进行筛选，将工程菌株接种于SC固体选择培养基上，置于30℃条件下培养至单菌落形成，选取该单菌落接种于YPD培养基中振荡培养，提取基因组进行PCR鉴定，鉴定结果为阳性的菌株接种于YPD液体培养基中过夜培养；取适量该菌液涂布于麦芽汁固体培养基和接种于麦芽汁液体培养基，培养24h观察重组工程菌株的形态；同时取上述菌液适量接种于加半乳糖的诱导培养基中进行诱导培养，利用ELISA检测rChIFN；

2)工程菌株的灭活：利用含有2％的半乳糖诱导培养基诱导培养至对数生长期的发酵菌液，直接经水浴灭活处理，制备得到抗病毒灭活酵母工程菌；

3)灭活菌灭活效果检测：将灭活工程菌重悬于2ml灭菌生理盐水后，取200μl涂布到YPD固体培养基中，置30℃倒置培养48h后，观察有无单菌落的形成；

4)灭活菌抗病毒活性检测：通过MTT实验检测灭活菌的抗病毒活性。

进一步地，步骤1)中的培养24h重组工程菌株的形态要求是：菌落的形态大而有光泽，且表面光滑湿润，在麦芽汁液体培养基中工程菌静置一段时间紧密排列于瓶底。

进一步地，步骤2)中的工程菌株的灭活条件：诱导培养至对数生长期OD₆₀₀为0.4的发酵菌液，灭活方式为水浴灭活，灭活温度为61-71℃，灭活时间为15min-45min。

进一步地，所述步骤4)中通过MTT实验检测灭活菌的抗病毒活性具体为：将鸡胚成纤维细胞以5.0×10⁴个/ml密度接种于96孔板中，每孔接种100μL，置37℃5％CO₂培养箱中培养，培养至80％细胞贴壁，每孔接种100μL混合液；培养10h后，弃去96孔板中液体，以100TCID₅₀病毒液每孔接种100μL，置培养箱中作用2h，弃病毒液用hanks液清洗2遍，接种新维持液，继续培养48h后，每孔加入20μL体积2mg/ml MTT液，继续培养4h；待培养结束后吸出孔内液体，以100μL/孔加入DMSO溶液，室温条件下，轻微震荡作用10min，使结晶物充分溶解；测定OD₄₉₀数值，根据如下公式计算病毒抑制率：

病毒抑制率(％)＝(实验组平均OD-病毒对照组OD)/(正常对照组OD-病毒对照组OD)*100。

进一步地，所述混合液的组成为10％FBS的DMEM 50μL与裂解液50μL以1:1的比例混匀。

进一步地，所述工程菌株为INVSC1/pYEIFNG和INVSC1/pYEIFNR工程菌。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：