[发明专利]一种抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法

权利要求书

1.一种抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)工程菌株的遗传稳定性鉴定：

利用SC选择培养基对工程菌进行筛选，将工程菌株接种于SC固体选择培养基上，置于30℃条件下培养至单菌落形成，选取该单菌落接种于YPD培养基中振荡培养，提取基因组进行PCR鉴定，鉴定结果为阳性的菌株接种于YPD液体培养基中过夜培养；取适量该菌液涂布于麦芽汁固体培养基和接种于麦芽汁液体培养基，培养24h观察重组工程菌株的形态；同时取上述菌液适量接种于加半乳糖的诱导培养基中进行诱导培养，利用ELISA检测rChIFN；

2)工程菌株的灭活：利用含有2％的半乳糖诱导培养基诱导培养至对数生长期的发酵菌液，直接经水浴灭活处理，制备得到抗病毒灭活酵母工程菌；

3)灭活菌灭活效果检测：将灭活工程菌重悬于2ml灭菌生理盐水后，取200μl涂布到YPD固体培养基中，置30℃倒置培养48h后，观察有无单菌落的形成；

4)灭活菌抗病毒活性检测：通过MTT实验检测灭活菌的抗病毒活性。

2.根据权利要求1所述的抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，其特征在于，步骤1)中的培养24h重组工程菌株的形态要求是：菌落的形态大而有光泽，且表面光滑湿润，在麦芽汁液体培养基中工程菌静置一段时间紧密排列于瓶底。

3.根据权利要求1所述的抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，其特征在于，步骤2)中的工程菌株的灭活条件：诱导培养至对数生长期OD₆₀₀为0.4的发酵菌液，灭活方式为水浴灭活，灭活温度为61-71℃，灭活时间为15min-45min。

4.根据权利要求1所述的抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中通过MTT实验检测灭活菌的抗病毒活性具体为：将鸡胚成纤维细胞以5.0×10⁴个/ml密度接种于96孔板中，每孔接种100μL，置37℃5％CO₂培养箱中培养，培养至80％细胞贴壁，每孔接种100μL混合液；培养10h后，弃去96孔板中液体，以100TCID₅₀病毒液每孔接种100μL，置培养箱中作用2h，弃病毒液用hanks液清洗2遍，接种新维持液，继续培养48h后，每孔加入20μL体积2mg/ml MTT液，继续培养4h；待培养结束后吸出孔内液体，以100μL/孔加入DMSO溶液，室温条件下，轻微震荡作用10min，使结晶物充分溶解；测定OD₄₉₀数值，根据如下公式计算病毒抑制率：

病毒抑制率(％)＝(实验组平均OD-病毒对照组OD)/(正常对照组OD-病毒对照组OD)*100。

5.根据权利要求4所述的抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述混合液的组成为10％FBS的DMEM 50μL与裂解液50μL以1:1的比例混匀。

6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的抗病毒灭活酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述工程菌株为INVSC1/pYEIFNG和INVSC1/pYEIFNR工程菌。