[发明专利]用于改善的蛋白质分泌的表达载体

说明书

本发明的目的是改善宿主细胞的蛋白质分泌以增加发酵过程中的蛋白质产量。这是通过表达载体实现的，所述表达载体包含a)启动子序列和b)编码蛋白质的核酸序列。蛋白质包含信号肽和额外的氨基酸序列，并且信号肽包含与SEQ ID NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，与SEQ ID NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与所述序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。

本申请是申请日为2012年5月25日、发明名称为“用于改善的蛋白质分泌的表达载体”的中国专利申请201280026365.0(国际申请号PCT/EP2012/059901)的分案申请。

本发明属于生物技术的领域，更特别是微生物蛋白质合成的领域。本发明尤其涉及用于制备蛋白质的表达载体，并另外提出了包含此类表达载体的宿主细胞。本发明还涉及此类表达载体和宿主细胞用于蛋白质制备的方法和用途。

为了制备蛋白质，可以利用表达目标蛋白的基因的宿主细胞，更特别是微生物。一般以使其表达的方式将目标蛋白的基因(转基因)导入到宿主细胞中。常见的是其与一个或多个允许基因表达的启动子序列(启动子)共同存在于所谓的表达载体上。

为了工业规模的生物技术生产，在发酵罐中培养所讨论的宿主细胞，根据细胞的代谢特性调整发酵罐。在培养过程中，宿主细胞代谢所供应的底物，并形成理想的产物，所述产物在发酵结束后通常与生产生物分离，并从发酵罐浆和/或发酵基质中纯化和/或浓缩。

固有地在发酵中获得非常高的产量是理想的。产量依赖于多种因素，例如除实际需要的产物外，宿主细胞通常形成多种一般非目的性的其他物质。此外，转基因的表达及产物的产量基本上取决于所使用的表达系统。例如，国际专利申请WO 91/02792公开了在优化的地衣芽孢杆菌中，在来自地衣芽孢杆菌的基团调控序列的控制下，更特别是地衣芽孢杆菌的启动子的控制下，来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶的改善的发酵生产。

为了工业生产蛋白质，例如水解酶，优选使用能够将大量蛋白质分泌到培养上清中的宿主细胞，使得不必进行复杂的细胞破碎，所述复杂的细胞破碎对于胞内生产是必需的。出于该目的，优选使用这样的宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种，其可以在有效的高细胞密度发酵方法中使用有成本效益的培养基培养，并能够将大量克/升的靶蛋白质分泌到培养上清中。通常，由表达载体表达待分泌的蛋白质，所述表达载体已经被导入到宿主细胞中并且编码待分泌的蛋白质。经表达的蛋白质通常包含使其从宿主细胞输出的信号肽(信号序列)。信号肽通常是在宿主细胞中翻译的多肽链的一部分，但其还可以在宿主细胞内或外，从蛋白质上翻译后切割掉。

尤其是对于异源蛋白质的胞外生产，然而存在多种瓶颈，并且相应的非常需要优化分泌过程。瓶颈之一是选择允许靶蛋白从宿主细胞有效输出的信号肽。原则上，信号肽可以是与蛋白质，更特别是与酶新组合的。例如Brockmeier等人的出版物(J.Mol.Biol.362，第393–402页(2006))描述了使用角质酶的实例分泌信号肽文库的策略。然而，不是每个信号肽也在发酵条件下，更特别是在工业或工业规模的发酵条件下，带来充足的蛋白质输出。

因此，本发明的目标是改善宿主细胞的蛋白质分泌，以及结果为增加发酵方法中的蛋白质产量。

本发明提供了表达载体，包含

a)启动子序列，和

b)编码蛋白质的核酸序列，蛋白质包含信号肽和另外的氨基酸序列，信号肽包含与SEQ ID NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与这些序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。

令人惊讶地发现，编码具有此类信号肽的蛋白质的表达载体实现了含有表达载体并且表达核酸序列b)的宿主细胞的改善的蛋白质分泌。结果是在本发明的优选的实施方案中，能够增加发酵方法中的蛋白质产量。