[发明专利]一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的分子标记引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的分子标记引物及方法。

背景技术

阿拉伯鱚隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属，外部形态与印度鱚相似：第一背鳍具XII-XIII硬棘，臀鳍具II硬棘及22-24软条，脊椎骨数38-40。阿拉伯鱚各鳍透明，第一及第二背鳍淡黄色，密布黑色小点；腹鳍和臀鳍黄白色；尾叉浅，近截形；尾鳍深褐色至深灰色。阿拉伯鱚同印度鱚一样，皆为巴基斯坦近海重要的经济鱼种，分布区重叠。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分阿拉伯鱚和印度鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的另一目的在于提供一种准确高效地鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的方法，将提取所得DNA序列与分子标记SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4比对；分子标记SEQ ID NO.3为：CAGGCATGGTGGGCACCGCCCTGAGCTTGCTGATCCGAGCAGAACTTAGCCAACCCGGCGCTCTACTTGGAGACGATCAAATTTACAACGTCATTGTTACGGCACACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTCTAATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAGTTCCGCTTATGATCGGAGCCCCTGACATGGCATTCCCTCGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTCCTGCCCCCTTCTTTCCTTCTCCTCTT；分子标记SEQ ID NO.4为：CAGGCATAGTGGGCACGGCCCTAAGCCTGCTAATCCGAGCAGAACTCAGCCAACCCGGCGCTCTGCTTGGTGATGACCAGATCTATAATGTTATCGTTACTGCACATGCCTTTGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCAATTTTAATCGGTGGCTTCGGAAACTGATTAGTTCCGCTAATGATCGGGGCGCCCGATATGGCATTCCCCCGGATAAATAATATGAGCTTCTGGCTTTTACCCCCTTCTTTCCTACTCCTCTT。两个分子标记序列存在39个碱基的差异，表现为6个颠换，33个转换，特征明显，且可重复性强，能够准确高效低鉴别阿拉伯鱚与印度鱚。

作为优选，分子标记SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的获取方法为：用用标准酚-氯仿法提取阿拉伯鱚基因组总DNA和印度鱚基因组总DNA，以总DNA为模板，以引物进行PCR扩增，扩增反应过程为：将2.5μL 10×buffer、2μL dNTPs、0.15uL rTaq酶、1μL上游引物、1μL下游引物、1μL模板DNA混合，再加入17.5μL灭菌水，将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞，对扩增结果进行纯化、测序。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响rTaq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少，所得的分子标记序列稳定一致。

作为优选，分子标记的获取过程中，上游引物序列为：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物序列为：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’ (SEQ ID NO.2)。上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。

作为优选，DNA提取过程为：用用用标准酚-氯仿法提取阿拉伯鱚基因组总DNA和印度鱚基因组总DNA，以总DNA为模板，以引物进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序；PCR扩增反应过程与上下游引物序列同上。依赖于酶促反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸” 三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。