[发明专利]一种通过检测细胞模型中的TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法

说明书

本发明实施例提供一种通过检测细胞模型中TGF‑β表达量评价冻干粉活性的方法，涉及生物技术领域，解决了冻干粉活性评价的问题，克服了毛囊干细胞和毛乳头细胞不易分离，难培养的困扰，并且TGF‑β作为一种细胞因子来体外评价生发冻干粉的活性，其操作方法简单，实用性强，可作为后期不同批次冻干粉使用前活性评价的参考依据。该通过检测细胞模型中TGF‑β表达量评价冻干粉活性的方法为首先制备人源性ADSCs冻干粉，并分别将生长期的表皮干细胞和黑色素细胞胰酶消化后制备单细胞悬液，先后取两种细胞单细胞悬液混合培养构建表皮‑黑色素细胞模型，之后在此模型上给与冻干粉共培养，RT‑PCR方法进行TGF‑β的表达量检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过检测细胞模型中TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法。

背景技术

随着社会竞争加剧，各种压力增大，都会使脱发的发病率呈逐渐上升，以及愈来愈年轻化的趋势。近年来，在我国各大医院脱发患者的门诊量在不断上升。脱发给患者的生活、精神和心理带来了极大的压力。目前市场上预防和治疗脱发的药物大多以中药为主，西药较少，治疗效果均不如意。如非那雄胺和米诺地尔，尽管使用后部分患者症状有所改善，但也因人而异，并不能从根本上解决问题，且均存在副作用，停药后也会反弹。有调查显示，约98%的脱发患者在使用了现有的防治脱发药物半年无效后会选择弃用。植发是近几年流行的新型技术，一般在中西药治疗无效之后，很多患者都会选用植发，但植发需要从自身后枕部健康毛发区取材再植入至前额、头顶等脱发区域，此过程操作时间长，患者有痛苦感，且价格昂贵，术后效果不能保证，还可能伴随有感染、肿胀等并发症。而现售的其它类型的生发产品、育发产品也都号称具有激活毛囊，促进生发的功效，但往往消费者使用后效果并不理想，同样的产品不同批次的甚至可能有红肿，瘙痒、蜕皮等不良反应，因此开发新的有效的生发药物有巨大的临床意义。

随着对毛囊微观水平认知的不断提高，人们意识到毛发再生受到毛囊干细胞及其周围微环境的调控。干细胞是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，具有向多种组织细胞分化的能力，因此开发针对于毛囊部位干细胞微环境修复的再生产品成为治疗脱发药物的发展趋势。

研究发现毛囊及其周围组织能通过自分泌和旁分泌产生一些生物活性因子，经各种途径影响毛发的生长发育和生长周期。其中，对毛囊有重要意义的细胞因子主要有：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor basic，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，这些细胞因子的深入研究为防治脱发提供了新的思路。但是，这类药物多难以直接通过皮肤屏障到达毛囊组织，在毛囊局部难以达到有效浓度；同时这些药物容易降解、生物活性也容易下降，从而影响其生发的效果。因此，含细胞因子类的生发药物如何保证细胞因子活性是首要解决的问题。

冻干粉是在无菌环境下将药液冷冻呈固态，抽真空将水分升华干燥后而成的无菌粉注射剂，能最大限度的保证药物成分的活性，便于运输，使用方便。目前市场上不乏效果较好的生发类冻干粉。中国专利CN200710093074.4公开了“一种人源性细胞因子生发剂及其制备方法”是将人成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞的培养上清液制成蛋白冻干粉末，之后将冻干粉末包封在脂质膜中，经过旋转蒸发，冻干后制成易于透过皮肤屏障，更加稳定的冻干粉。此发明所制备的冻干粉有明显的生发效果，但此冻干粉制备过程过于复杂，使用的细胞种类繁多，而且对设备要求高，在临床使用有一定的限制性。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一种从脂肪组织中分离出来的具有多种分化潜能的干细胞，能分泌多种细胞因子，包括HGF、VEGF、FGF、IGF等，且脂肪干细胞存在于皮下脂肪层中，获得来源广泛，分离步骤简单。因此，脂肪干细胞培养液成为制成生发冻干粉的良好选择。