[发明专利]片断DNA检测方法、片断DNA检测试剂盒及其应用

说明书

本申请是申请日为2012年07月11日和发明名称为“片断DNA检测方法、片断DNA检测试剂盒及其应用”的201280003508.6号发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种片断DNA检测方法、片断DNA检测试剂盒及其应用。

背景技术

科研人员在进行分子生物学研究时，需从各种不同的组织标本中提取DNA。其中，体液中含有片断化的DNA，对片断化的DNA进行检测是分子生物学研究的重要步骤。例如血浆DNA，又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸(主峰约167bp)，可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的DNA片段。血浆DNA来源于少量衰老死亡细胞的DNA释放。血浆DNA的生成与清除处于动态平衡状态，维持在较恒定的低水平，1mL血浆约含有2000个基因组DNA的量，含量极低，以致于采用现有技术中的PCR技术检测不到其基因信息。

另外，新鲜组织标本来源有限，FFPE方法解决了新鲜组织难与长久保存的难题，但在FFPE组织标本的制备和贮存过程中，组织经福尔马林固定、石蜡包埋后很容易引起DNA的交联和片断化为100bp-3000bp片断，科研人员很难获得足量高质量的DNA样本用于高敏度的检测。目前，世界上有大量样本是使用FFPE方法处理的，而这些组织样本已经成为科学研究最为常见的生物学资源之一。

传统检测片断DNA是否存在碱基突变或其他变异的方法主要通过对要检测的特定区域进行PCR放大然后进行检测。传统的PCR技术通常是采用一对跨越目标区两侧的引物，以DNA为模板在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目标DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。广泛应用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，以及疾病的诊断。但PCR技术要求一对引物间的DNA模板不能存在断裂点，这为片断化严重的DNA模板带来了很大挑战。因为，传统PCR扩增要求被放大的区域保持完整，所以传统的方法对片断DNA的检测灵敏度很低，限制其在检测片段DNA样品中的应用。

发明内容

本发明旨在提供一种片断DNA检测方法、片断DNA检测试剂盒及其应用，以解决现有技术中片断DNA检测灵敏度低的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种片断DNA检测方法。该方法包括以下步骤：根据片断DNA的待检位点或待检区域设计引物；将片断DNA进行环化，得到环化DNA；利用引物对环化DNA进行PCR扩增；以及对PCR扩增的产物进行检测。

进一步地，引物是一对相邻且背向延伸的引物对。

进一步地，背向延伸的引物对中的引物均位于片断DNA的待检位点或待检区域的5’端或3’端。

进一步地，背向延伸的引物对之间间隔片断DNA总碱基对的0～1/2。

进一步地，背向延伸的引物对之间间隔0～50对碱基对。

进一步地，背向延伸的引物对之间间隔0～10对碱基对。

进一步地，背向延伸的引物5’端部分碱基重叠。

进一步地，引物为一条引物。

进一步地，在对片断DNA进行环化之前，进一步包括对片断DNA进行预扩增的步骤。

进一步地，环化采用的是CircLigase介导的双链DNA环化。

进一步地，片段DNA包括血浆游离DNA、尿液游离DNA、汗液游离DNA、唾液游离DNA或福尔马林固定石蜡包埋组织提取的DNA。

进一步地，片断DNA的待检测位点或待检区域具有插入、缺失、替换或基因融合突变。

根据本发明的另一个方面，提供一种片断DNA检测试剂盒。该试剂盒包括：DNA提取试剂、DNA环化酶、目标DNA扩增引物及扩增试剂。

进一步地，该试剂盒包括：目标DNA预扩增引物及预扩增试剂。

进一步地，目标DNA扩增引物是一对相邻且背向延伸的引物对。

进一步地，背向延伸的引物对中的引物均位于片断DNA的待检位点或待检区域的5’端或3’端。

进一步地，背向延伸的引物对之间间隔到1/2片断DNA的碱基对。

进一步地，背向延伸的引物对之间间隔0～50对碱基。

进一步地，背向延伸的引物对之间间隔0～10对碱基。

进一步地，背向延伸的引物5’端部分碱基重叠。

进一步地，目标扩增引物为一条引物。