[发明专利]筛选抗结核药物的组合物、筛选模型和筛选方法

说明书

本发明提供筛选抗结核药物的组合物、筛选模型和筛选方法。具体地，本发明提供一种异源表达天冬氨酸半醛脱氢酶(ASD)的方法，其包括以下步骤：(1)将含有pET28a(+)::asd表达质粒的菌株转接于含Km和提高细胞渗透压的试剂的培养基中，培养得到转接培养物,其中，所述提高细胞渗透压的试剂的浓度为500‑1000mM；(2)将IPTG加入到所述转接培养物中，并于20℃‑23℃下培养得到表达ASD的菌体细胞，其中，IPTG终浓度为5‑20μM(优选10‑15μM)；(3)收集步骤(2)中得到菌体细胞，裂解，得到ASD。本发明还提供含有所述ASD的筛选抗结核药物的组合物、筛选模型和筛选方法，可快速、经济地高通量筛选抗结核药物。

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及筛选抗结核药物的组合物、筛选模型和筛选方法。

背景技术

利福平(rifampin)、异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)等抗结核药物的广泛应用，大大降低了结核病的死亡率。然而随着这些抗结核药物的长期使用以及不合理或不规范用药，出现了单药耐药(single drug resistance，SDR)、多药耐药(multidrugresistance，MDR)甚至广泛耐药(extensivedrug resistance，XDR)的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)。统计数据表明：新感染结核病的患者中3.7％是MDR-TB感染者，复治患者中MDR-TB携带率则高达20％，而MDR-TB患者中XDR-TB患者更是高达9.0％。耐药MTB的不断产生与传播，降低了结核病的治愈率，而感染MDR和XDR MTB的结核病患者的死亡率更是大幅提升。由此可见耐药MTB的出现与蔓延使得结核病再次成为威胁人类健康的重大传染病，研制新型抗耐药MTB的药物迫在眉睫。

抗结核药物的研发已经成为全球的研究热点，但新型抗结核药物的研究进展极为缓慢，远远不能满足临床对耐药结核病的治疗需求，以至于临床专家发出了结核病将无药可治的呼吁。缺乏可用于药物开发的新靶标是阻碍抗结核药物研发进程的主要原因，靶标匮乏成为抗结核药物研发的瓶颈。目前用于抗结核药物研发的靶标仅有InhA、EmbAB、DNA回旋酶、RNA聚合酶等非常有限的几个，基于这些靶标开发的抗结核药物被广泛应用于结核病的临床治疗。由于靶标基因发生突变，对这些药物具有耐药性的菌株也不断涌现。Bedaquiline和Delamanid是近50年来研制成功的、仅有的2个抗结核药物，对敏感和耐药MTB均有很好的抑制效果，可有效治疗耐药MTB引起的结核病。它们的共同之处就是与传统抗结核药物的作用机制不同，其作用位点是全新的药物新靶标。

天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartate-semialdehyde dehydrogenase，ASD)是结核分枝杆菌天冬氨酸代谢途径的第二个酶，生物信息学分析表明该酶基因是MTB的必需基因。对构建的MTB的asd条件突变株开展生理研究发现，下调asd的表达会影响MTB的增殖，其细胞壁合成被阻断从而破坏细胞正常的长杆状结构，不具有完整细胞结构的MTB感染巨噬细胞的能力也受到破坏。研究表明，asd的表达对维持MTB的正常生理功能十分重要，是一个潜在的抗结核药物靶标。

早期科研工作者根据ASD催化可逆的特点，以天冬氨酸半醛、NADP和磷酸为底物，建立了Streptococcus pneumoniae，Vibrio cholerae，Candida albicans和Escherichiacoli的ASD抑制剂筛选模型。但是由于底物天冬氨酸半醛不稳定，容易被氧化为天冬氨酸，目前已经没有市售天冬氨酸半醛的报道。

虽然MTB的ASD在2005年就有被表达的报道，但是按照相关方法我们没有能够得到足量且具有活性的酶。我们通过探索表达载体、宿主菌以及融合表达、分泌表达等方式对MTB ASD表达的影响发现，表达的ASD主要为包涵体，即使从中获得极少量可溶性的ASD也检测不到酶活性。在查询近十年来关于MTB ASD文献也发现，几乎没有进展，只有在2015年有利用计算机虚拟筛选的方式开展MTB ASD抑制剂筛选的报道。可能的原因也是难以突破MTBASD表达的瓶颈。