[发明专利]多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种多重扩增子测序用引物系统、其应用及测序文库的构建方法。该引物系统包括第一轮反向特异性引物组和第二轮正向特异性引物组。其中第一轮反向特异性引物组包括多个不同的第一轮反向特异性引物，每个所述反向特异性引物从5’端至3’端分别为反向接头序列、条形码序列和反向特异性序列。分子条形码序列提供了一种很好的方法来跟踪错配，利用下游分析，聚合酶在PCR过程中产生的错配可以与原始分子中出现的序列变异区分开来，最后通过去除低水平的假阳性来提高1％或更低的突变的检测准确率。通过计算读数中唯一的分子条形码序列数量，而不是计算总读数的数量，也可以更好地实现目标量化，因为总读数更有可能被非均一性扩增的所误读。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法。

背景技术

高通量测序(又称下一代测序，NGS)技术在发现和转化研究的诸多方面已逐渐成为一种被广泛采用的技术，目前其主要应用于基因组DNA的变异分析和RNA的表达分析。这些分析的范围可以是整个基因组和转录组，也可以是特定的区域或多个基因组合的靶向测序。靶向测序尤其有利于实现对感兴趣区域的高覆盖，同时可以控制测序成本和数据判读的复杂性。测序覆盖度高对于癌症等低频突变尤为重要，例如，对于检测单个核苷酸变异(SNVs)的平均序列深度超过1000次，有比较好的可信度，但是对于小于5％的核苷酸变异，则需要更高的测序深度来检测。

富集目标区域的方法有很多种，最常用的方法是：1)利用目标特异的探针从样本DNA中提取出杂交捕获产物；2)利用特定的引物扩增富集样本DNA。虽然在引物设计和PCR反应优化方面还需要付出更多的努力，但因PCR过程更容易处理、需要总体时间较少、目标富集更为具体和明确、并且能够适应更低的起始DNA浓度等，目前多数仍然采用基于PCR扩增来富集扩增子。

随着高多重PCR的出现，现在成千上万的扩增子可以同时扩增。然而，现有目标富集、文库准备和测序步骤等所有利用DNA聚合酶的扩增过程，都会引入非均一扩增和错配(聚合酶错误生成序列变化)。PCR非均一性扩增对精确定量有很大的影响，因为最后的测序读数可能不会准确地代表原始DNA或者RNA片段的相对丰度。聚合酶在PCR扩增循环中将最有可能导致许多失误(“false”)，这些低水平的变异易导致难以识别真正的低频率的突变。这些问题的根源是在PCR过程中相同的引物分子对不同的初始原始分子的多次采样。这些问题在需要更多的PCR循环处理低起始量的DNA或质量差的DNA时会加剧。

发明内容

基于此，有必要提供一种有利于提高结果精确度的多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种多重扩增子测序用引物系统，包括第一轮反向特异性引物组和第二轮正向特异性引物组；其中，

所述第一轮反向特异性引物组包括多个不同的第一轮反向特异性引物，每个所述反向特异性引物从5’端至3’端分别为反向接头序列、条形码序列和反向特异性序列，所述第一轮反向特异性引物组中的多个不同的第一轮反向特异性引物的条形码序列不同，且所述第一轮反向特异性引物组中的多个不同的第一轮反向特异性引物的反向特异性序列分别与待测目标区域的不同区段互补；

所述第二轮正向特异性引物组包括多个不同的第二轮正向特异性引物，每个所述第二轮正向特异性引物从5’端至3’端分别为正向接头序列和正向特异性序列，所述第二轮正向特异性引物组中的多个不同的第二轮正向特异性引物的正向特异性序列分别与待测目标区域的不同区段互补。

在其中一个实施例中，所述反向接头序列和/或所述正向接头序列的长度为18～24mer，优选为21mer。

在其中一个实施例中，所述条形码序列的长度为6～12mer，优选为10mer。