[发明专利]一种高活性S-氰醇裂解酶及其应用

说明书

本发明提供了一种高活性S‑氰醇裂解酶及其应用，具体地本发明对野生型S‑氰醇裂解酶的103位氨基酸残基进行突变能够显著提高突变酶在大肠杆菌中的表达，而且诱导表达时不需要降低温度，因而显著地降低了酶的制备成本；进一步地对第128位等其它位点进行突变获得了催化活性提高的S‑氰醇裂解酶，实验结果表明，该类突变的S‑氰醇裂解酶在催化间‑苯氧基苯甲醛(m‑PBAld)和HCN的加成反应的催化活性与野生型相比提高了2倍以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种高活性S-氰醇裂解酶及其应用。

背景技术

氰醇裂解酶是一种在化工生产中非常有用的工业用酶，其天然活性是催化氰醇的裂解并释放出氢氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反应，即HCN与醛酮的加成，得到具有光学活性的α-氰醇产物。间苯氧基苯甲醛(m-PBAld)的S-型氰醇(SCMB)是菊酯类农药的关键中间体。传统的化学法存在立体选择性不高的问题，而S氰醇裂解酶催化的SCMB生产工艺具有选择性。

天然的S-氰醇裂解酶存在于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织中，丰度低，纯化难度大。1995年，Wajant采用五步纯化法从木薯中分离得到了木薯氰醇裂解酶MeHNL(Plant Sci.,1995,108,1)；White等人采用三步法从木薯叶中提取了MeHNL，采用盐析和透析的方式得到了酶液，但是应用于化学催化的立体选择性不高(Plant Physiol 1998,116,1219)。来源于木薯(Manihot esculenta)的氰醇裂解酶(MeHNL)是一种S-氰醇裂解酶，已有文献报道将MeHNL用于催化S-型手性氰醇的化学合成，ee值>99％，具有重要的应用价值，但是酶活仍然不够高，难以达到实际应用的要求。

因此，本领域技术人员致力于开发具有更高活性的S-氰醇裂解酶，以降低应用成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性S-氰醇裂解酶及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种突变的S-氰醇裂解酶，所述突变的S-氰醇裂解酶在选自下组的一个或多个位点发生突变：第103位氨基酸残基、第128位氨基酸残基、第2位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第149位氨基酸残基、第94位氨基酸残基、和第176位氨基酸残基，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的催化活性是野生型S-氰醇裂解酶的至少2倍；优选地至少5倍；更优选地至少10倍。

在另一优选例中，所述野生型S-氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的氨基选序列与SEQ ID NO.1相比具有至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的突变位点包括第103位氨基酸残基；优选地，第103位氨基酸残基由H突变为L、I、V、C、S或M。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的突变位点还包括第128位氨基酸残基；优选地，第128位氨基酸残基由W突变为A。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的突变位点还包括第2位氨基酸残基；优选地，第2位氨基酸残基由V突变为P、L、D、I、G、H、R、M、S、C、W、T、Q、或A。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的突变位点还包括第81位氨基酸残基；优选地，第81位氨基酸残基由C突变为A、V或I。

在另一优选例中，所述突变的S-氰醇裂解酶的突变位点还包括第149位氨基酸残基；优选地，第149位氨基酸残基由L突变为I、C、A或P。