[发明专利]一种重组人溶菌酶纯化方法

说明书

本发明公开了一种重组人溶菌酶纯化方法，先用疏水层析柱对大批量的重组人溶菌酶进行粗纯，然后直接用弱阳离子交换层析柱进行精纯，本发明与已有技术相比，工艺过程简单易操作，在保证纯度前提下大大提高了回收率以及活性，实现了低成本、高收率的重组人溶菌酶产业化要求。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组人溶菌酶的纯化方法。

背景技术

最早对溶菌酶的研究起于Nicolle1907年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子，1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体，揭开了研究溶菌酶的历史篇章。1965年，英国的菲利普等用X衍射法对溶菌酶进行研究分析，第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构。

溶菌酶具有抗菌、抗病毒和消炎作用，与抗生素复合应用能增强抗生素疗效。它还是人体内的非特异性免疫因子，可提高机体的免疫力，并且与其他阳离子抗菌肽类天然防御因子有很好的协同作用。另外，它本身是一种天然蛋白质，能在胃肠道作为营养物质消化、吸收，无毒性，也不在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。溶菌酶常用于各种加工食品和饮料中，集药理、保健和防腐三种功能于一体。

在国内溶菌酶尚未得到充分应用，主要是国内生产溶菌酶数量少，质量差，医药、食品及科研用溶菌酶仍依赖进口。目前主要用鸡蛋白为原料来提取溶菌酶，但成本高，投资大，工艺复杂。随着食品工业、微生物工业和生物工程技术的迅速发展，随着溶菌酶在医药上的推广应用，人们对溶菌酶的需求量与日俱增。除鸡蛋外，开发新的溶菌酶资源是一个亟待研究的新课题。与此同时，人们对溶菌酶质量上的要求也越来越高，因此必须寻找新的溶菌酶分离纯化工艺，努力提高溶菌酶产品纯度及其酶活性，极力满足社会的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种工艺简单，所需溶剂少，产品的纯度和回收率高，适合大批量生产的重组人溶菌酶的纯化方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、超滤粗纯

将重组人溶菌酶发酵液离心分离，所得上清液过0.2μm中空纤维膜进行超滤除菌，收集滤出液。

2、疏水层析

向步骤1得到的滤出液中加入NaCl，使滤出液中NaCl浓度为1.0～1.5mol/L，然后通过疏水层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相B洗脱，洗脱流速为180～240mL/min，收集流动相B的洗脱液。

3、离子交换层析

将步骤2收集的洗脱液调pH至7.0～8.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相C洗脱，再用流动相C与流动相D体积比为84:16的混合液洗脱，最后用流动相C与流动相D体积比为80:20～50:50的混合液洗脱，洗脱流速为30～40mL/min，收集流动相C与流动相D体积比为80:20～50:50时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组人溶菌酶。

上述的流动相A是含1.0～1.5mol/L NaCl的pH＝7.0～8.5的PB缓冲液；流动相B是pH＝7.0～8.5的PB缓冲液；流动相C是pH＝7.0～8.0的PB缓冲液；流动相D是含1mol/L NaCl的pH＝7.0～8.0的PB缓冲液。

上述疏水层析柱的填料优选粒径为45～160μm的苯基高流速琼脂糖填料，填料对蛋白质的吸附容量不得小于30mg/mL，线性流速不得高于8mL/cm。

上述弱阳离子交换层析柱的填料优选粒径为40～120μm的高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.08mmol/mL，线性流速不得高于12mL/cm。