[发明专利]一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法

说明书

技术领域

一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，属于生物检测领域。

背景技术

赭曲霉毒素是真菌产生的一组结构类似物，主要有A、B、C、D四种化合物，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、产毒量最高、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A。赭曲霉毒素A是由曲霉属和青霉属产生的有毒代谢产物，主要由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉产生，广泛分布于自然界，在谷物及其制品、动物饲料、动物制品、可可和巧克力等产品中污染率较高，具有强烈的肾脏毒性和肝脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作用，因此对人类健康构成和畜牧业发展巨大的潜在威胁，因此开发超灵敏的赭曲霉毒素A检测方法尤为重要。

目前检测赭曲霉毒素A的仪器方法有液相色谱、气相色谱、质谱和毛细管电泳法等，虽然这些方法灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选，限制了此类方法的大规模应用。基于抗原抗体反应的免疫学方法没有昂贵仪器的限制，但是高灵敏度高选择性的抗体制备需要较长的周期，同时抗体的稳定性也极易受到所处环境的限制，因此对检测效果的稳定性具有很大的影响。适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选的一类能够识别目标分子的一段单链DNA或RNA分子，这类分子对目标分子的识别具有高亲和性，并且具有稳定性好、易于制备、重复使用、易于修饰等优点，因此适配体作为识别分子被广泛应用于生物检测中。

金纳米粒子具有独特的光学特性，包括：表面等离子共振、较高的吸收和消光系数以及依赖于粒径和距离的一些性质，使得金纳米粒子作为生物探针已广泛应用于基础和应用研究，尤其是根据金纳米粒子聚集程度的变化而显现出的颜色变化，可以开发通过肉眼可以识别的比色传感器，使得生物分子的检测更加便捷。连接酶链式反应是在热稳定的DNA连接酶的作用下，可以实现较短双链DNA分子切口的连接，因此在模板存在的条件下可以将金纳米粒子修饰的两段DNA探针分子与模板互补杂交，形成的切口通过连接酶进行连接形成一条完整的DNA链，再以新形成的金纳米粒子单链DNA分子为新的模板，通过加入探针分子再次形成起始模板分子，从而实现模板链和金纳米粒子单链DNA分子的扩增，起始模板含量越多，扩增出的的金纳米粒子单链DNA分子越多，金纳米粒子颜色越深。

本发明借助于赭曲霉毒素A适配体特异性识别赭曲霉毒素A分子，从而使得与适配体部分碱基互补的DNA分子解离下来，以解离下的DNA分子为模板，并以与模板互补的金纳米粒子修饰的两种DNA分子和与模板序列相同的两种DNA分子为探针，通过连接酶链式反应进行扩增，在不同浓度赭曲霉毒素A的条件下，随着赭曲霉毒素A浓度的增加，解离下的用于连接酶链式反应的模板DNA分子越多，则DNA探针修饰的金纳米粒子的组装程度越大，金纳米粒子颜色越深，根据赭曲霉毒素A的浓度与紫外吸收比值A630/A521的对应关系，从而对赭曲霉毒素A的含量进行检测。

发明内容

要解决的技术问题：由于传统仪器检测方法设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选，限制此类方法的大规模应用；基于抗原抗体的免疫学方法依赖抗体的灵敏度和特异性，因此抗体的质量限制了免疫学方法的灵敏度和准确性。

技术方案：本发明公开了一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，包括如下具体步骤：

（1）磁纳米粒子修饰赭曲霉毒素A适配体

将新合成的粒径为200-400nm浓度为1mg mL^-1的羧基修饰的磁纳米粒子，用pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液稀释10倍，再向1mL稀释好的磁纳米粒子中加入0.068 mg 碳二亚胺和0.15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将其放到摇床上在室温条件下振荡活化20min，然后将50μL浓度为10μM的3’端氨基修饰的赭曲霉毒素A适配体DNA片段加入以上活化好的磁纳米粒子中，室温条件下振荡反应3h后，用磁力架吸附磁纳米粒子使其在离心管底部聚集，同时去除上清液以除去未偶联的游离适配体DNA分子，然后加入1mL 0.01M的pH8.0的TE缓冲液（Tris和EDTA）将磁纳米粒子进行重悬；

赭曲霉毒素A适配体: 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAA

AA-NH₂-3’。

（2）磁纳米粒子修饰的适配体与部分互补DNA分子形成部分杂交DNA双链结构