[发明专利]一种质粒载体及其构建方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。质粒载体为闭合环状的双链DNA，含有两个多克隆位点区，在两个多克隆位点区之间存在一个ccdB表达框，可在多数大肠杆菌菌株中组成型表达毒性蛋白ccdB，作为负筛选标记。基于质粒载体的多克隆位点的设计，该质粒可用于进行定向TA克隆和改进的无背景粘性末端克隆。另外，本质粒载体还可以直接用于蛋白表达和纯化。各功能均得到验证。本发明所涉及的质粒载体因其更方便和高效，将在基因工程领域发挥重要的作用。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。

背景技术

分子克隆是研究基因结构和功能的基础，是分子生物学的核心技术。分子克隆方法可分为两类：依赖连接酶的克隆和不依赖连接酶的克隆。其中，依赖连接酶的克隆方法主要有三种，包括：平末端连接、粘性末端连接和TA克隆。近些年，各种不依赖连接酶的克隆策略也得到快速发展，比如：CPEC、FastCloning、Gateway、LIC、OEC、PIPE、SLIC、SLiCE、USER和重组酶克隆等技术（Yao S, Hart DJ, An Y. Recent advances in universal TAcloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel. 2016; 1-6.）。尽管不依赖连接酶的克隆方法有很多成功的应用实例，但是仍然不能完全取代依赖连接酶的克隆方法。

作为一种依赖连接酶的克隆方法，粘性末端连接方法是目前应用最为广泛的分子克隆方法之一。但在某些情况下，由于无法获取合适的限制性酶切位点，因此为粘性末端克隆带来了不便。另外，由于产生粘性末端的酶切位点都具有回文结构，经酶切后的末端能与其自身互补，所以容易在后续的克隆步骤中产生两个质粒载体之间的连接和环化，从而产生假阳性。而TA克隆方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq聚合酶）的末端转移酶活性，在聚合酶链式反应（PCR）扩增插入片段的过程中在产物的3'端额外加入一个碱基“A”。而TA克隆所使用的T载体的3'端有一个凸出的碱基“T”，刚好可以与上述插入片段的3'末端的碱基“A”互补配对，通过连接可以实现TA克隆。TA克隆是目前克隆PCR产物最快捷、简便的方法之一。该方法无需选择合适的酶切位点，甚至可用于克隆序列未知的DNA片段。目前， T载体的制备方法常见的有两种。一种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用某些内切酶酶切能够产生3'端具有单个凸出的碱基“T”的线性T载体。另一种方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq酶）不依赖模板的末端转移酶活性，将单个脱氧胸腺核苷酸（dTTP）添加到线状载体3'端（Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts. Nucleic Acids Res. 1991;19(5):1154.）。与第二种方法相比，第一种方法更稳定、快捷、高效。另外，第二种方法在制备T载体时，会出现加尾效率较低和加尾过程中线性质粒两端的序列有时会被部分删除等问题（Shuman S. Novel approach to molecularcloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. J BiolChem. 1994 Dec 23;269(51):32678-32684.）。目前TA克隆主要存在的问题是克隆过程中片段可以随机的以正反两个方向插入到T载体中，这就造成了至少有一半的克隆外假阳性，从而增加了筛选的压力。