[发明专利]一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4‑二羟基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4-二羟基丁酸的方法，属于生物合成技术领域。

背景技术

3,4-二羟基丁酸(3,4-dihydroxybutyric acid,3,4-DHBA)，是一种易溶于水、乙醇和乙醚的通用手性化合物，其含有一分子羧基和两分子羟基的分子结构使得它可以经修饰形成许多有用的衍生物，如可用于合成抗生素、α-氨基酸、β-氨基酸和多肽等，或是作为手性合成的基础材料。

3,4-二羟基丁酸可通过简单地皂化反应形成环状的内酯物质3-羟基-γ-丁内酯(3-hydroxy-γ-butyrolactone，3HBL)，3-羟基-γ-丁内酯也是一种非常重要的手性C4化合物，可用来合成各种药物、聚合物和溶剂。例如制备降血脂药物阿托伐他汀、神经介质L-肉毒碱(Larcheveque,1990)、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus；HIV)蛋白酶抑制剂氨普那韦、饱感剂(2S,4S)-2-羟基-4-羟甲基-4-丁内酯、治疗皮肤病药羟基二十碳四烯酸(12-HETE)和抗癌药aplysistatin(单环金合欢烷类，是一种珊瑚药物)等。将(S)-3-羟基-γ-丁内酯还原可得(S)-3-羟基四氢呋喃，(S)-3-羟基四氢呋喃是治疗艾滋病药物的一种重要中间体；将(S)-3-羟基-γ-丁内酯转化为(S)-5-羟甲基-1,3-唑啉-2-酮，可得最新一代的抗菌药物。此外，由3-羟基-γ-丁内酯经简单的转换而得到的(S)-N-甲基-3-羟基吡咯和(R)-N-甲基-3-甲氮基吡咯也都具有重要的生理活性。由于(S)-3-羟基-γ-丁内酯广泛的用途，其被美国能源部定义为最具价值的化合物之一。但是，现有关于3,4-二羟基丁酸的合成方法报道较少，限制了3,4-二羟基丁酸的大范围推广使用。

现有技术中，有关3,4-二羟基丁酸化学合成的报道主要以对其内酯物质3-羟基-γ-丁内酯的皂化化学合成为主。此外，Hollingsworth等人在美国专利(US 5292939)中称可利用葡萄糖和碱金属氢氧化物作为反应物，在双氧水存在的情况下经70℃加热反应24h也可获得3,4-二羟基丁酸，但该过程产率低，反应时间长，并不存在实际生产的可能性。还有将(R)-3-氯-1,2-丙二醇经氯化和水解直接形成3,4-二羟基丁酸的方法，但是该方法因底物较难获取也不具备实际生产的可行性(美国专利US4994597)。

目前，有关3,4-二羟基丁酸生物合成的研究非常少。有报导关于生物合成3,4-二羟基丁酸的研究有且仅有麻省理工的化学工程系Prather团队，该团队在2013年和2014年分别发表了两篇关于利用代谢系统改造的大肠杆菌以葡萄糖为底物，生物合成3,4-二羟基丁酸的文章，但是，所述利用葡萄糖生物合成3,4-二羟基丁酸的代谢通路的合成能力较低，对底物葡萄糖的转化效率不高，而且该通路会有很多其他代谢物质的生成。

其中，2013年麻省理工的化学工程系Prather团队中的Martin等人在Nature Communications发表文章，通过利用葡萄糖和一些可提供酰基辅酶A(酰基CoA)的前体物质作为原料，通过从头合成法构建了以3-羟基酸作为平台化合物合成3,4-二羟基丁酸和其他多种平台化合物的方法，利用该方法在生成3,4-二羟基丁酸的同时，还产生了其他代谢产物：3-羟基戊酸(3HV)、3-羟基己酸(3HH)和3-羟基-4-甲基戊酸(3H4MV)，其中3-羟基戊酸作为主要的合成物质，产量可达1.3g/l，成为该方法碳源的主要流向。该文章中，3,4-二羟基丁酸是利用来自埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)中具有广泛底物特异性的乙酰辅酶A转移酶(Pct)将一系列短链羧酸类前体物质如丙酸、丁酸、异丁酸或乙醇酸激活以供应酰基辅酶A，之后利用硫解酶基因BktB缩合酰基辅酶A和葡萄糖经代谢产生的乙酰辅酶A，缩合形成3-酮基-辅酶A，之后经还原和硫解两步反应合成的，产量为555±52mg/l(Martin,C.H.et al.A platform pathway for production of 3-hydroxyacids provides a biosynthetic route to 3-hydroxy-g-butyrolactone.Nat.Commun.4:1414doi:10.1038/ncomms2418(2013).)。