[发明专利]一种用于特异性识别DNA序列的纳米探针及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属于检测分析及分子生物学技术领域，具体涉及三角形和十字形的DNA折纸结构作为探针对相同序列的目标基因的特异性标记，实现对环形和线形DNA的高分辨基因序列的定位。

背景技术

基因定位(Genemapping)是基因组测序、医疗诊断和病原菌鉴定等领域中的重要手段，包括在染色体上定位基因片段以及测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离这两个方面。根据形态性状不同进行标记和利用同工酶标记是两种主要的传统基因定位方式，基于基因表达的结果来间接反映标记效果。近几十年中，现代分子生物学技术蓬勃发展，一种新兴的遗传标记技术正日渐成熟，那就是DNA分子标记(DNA mapping)。DNA分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映。和形态标记及同工酶标记相比，分子标记具有无可比拟的优越性：①它们对表型无影响；②大多数的分子标记是共显性的，对隐性性状的选择十分便利；③由于基因组DNA的变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的。分子标记的所有这些特征，奠定了它具有广泛的应用性基础。

在DNA纳米技术领域，为实现DNA分子标记，奠基人Seeman教授曾利用DNA折纸实现单核苷酸多态性可视化。DNA折纸首先由著名科学家Rothemund提出，他利用一条M13mp18噬菌体环状单链DNA为骨架链(scaffold)，设计合成216条订书钉链与骨架链碱基互补配对，从而有效地折叠成二维结构，即DNA折纸。DNA折纸具有很好的位点可寻址性且位点间的“分辨率”可以达到4-6nm。利用荧光分子实现DNA分子标记是基于DNA纳米技术的另一种应用技术。利用核酸内切酶作用于单分子DNA，再通过DNA聚合酶发挥作用并携带荧光分子标记在特定位点，并在全内置反射荧光显微镜下观察。基于荧光分子标记的DNA分子标记方法，与DNA折纸探针的特异性标记相比，其分辨率受限于光学衍射极限的限制。而DNA折纸探针具有构象的多样性和修饰位点的可寻址性，在原子力显微镜可实现高分辨率的直接可视化观察。

本发明基于DNA折纸技术，获得了一种新型的纳米探针，该探针可用于特异性识别DNA序列。

发明内容

为克服现有技术的上述不足，本发明提供一种新型的用于特异性识别DNA序列的纳米探针及其应用方法，可以实现单分子DNA上具有相同序列的基因的定位。

本发明提供一种用于特异性识别DNA序列的纳米探针，所述探针为DNA折纸探针，具有三角形或十字形结构。

所述DNA折纸探针按照Rothemund和Seeman的方法制备，并使用100kDa超滤管离心除去多余的订书钉链或琼脂糖电泳纯化并利用Freeze’N Squeeze DNA凝胶抽提离心柱(Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns)浓缩回收。

本发明还提供上述用于特异性识别DNA序列的纳米探针的应用方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一：制备DNA折纸探针；按照Rothemund和Seeman的方法制备折纸，并使用100kDa超滤管离心除去多余的订书钉链或琼脂糖电泳纯化并利用Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns浓缩回收；

步骤二：构建基于闭合环状单链DNA的PhiX 174模型或线性双链DNA的Lambda模型；构建模型时采用由三部分组成的“双嵌段”DNA引物，一部分与目标DNA特定位点结合并有效地延伸，另一部分与DNA折纸探针杂交，中间通过一小段Spacer链将这两部分连接起来；且在延伸单链形成双链的过程利用Vent(exo^-)DNA聚合酶。

步骤三：折纸探针的特异性标记；将过量DNA折纸探针与标记有特定双嵌段引物的目标DNA分子混合反应12小时以上；

步骤四：原子力显微镜下成像观察。

步骤一中，所述不同构象的DNA折纸探针，基于折纸结构的可塑性和可寻址性，可以选择任意形状、任意修饰的DNA折纸探针，进行目标基因的多色标记。

所述步骤二中，设置引物部分和捕获链部分的序列长度，形成多个组合的双嵌段引物，并用于延伸PhiX 174闭合环状单链DNA，探索该双嵌段引物的延伸效果。