[发明专利]一种用于特异性识别DNA序列的纳米探针及其应用方法

权利要求书

1.一种用于特异性识别DNA序列的纳米探针，其特征在于，所述探针为DNA折纸探针，具有三角形或十字形结构。

2.根据权利要求1所述用于特异性识别DNA序列的纳米探针，其特征在于，所述DNA折纸探针按照Rothemund和Seeman的方法制备，并使用100kDa超滤管离心除去多余的订书钉链或琼脂糖电泳纯化并利用Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns浓缩回收。

3.一种如权利要求1或2所述的用于特异性识别DNA序列的纳米探针的应用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：制备DNA折纸探针；

步骤二：构建基于闭合环状单链DNA的PhiX 174模型或线性双链DNA的Lambda模型；构建模型时采用由三部分组成的“双嵌段”DNA引物，一部分与目标DNA特定位点结合并有效地延伸，另一部分与DNA折纸探针杂交，中间通过一小段Spacer链将这两部分连接起来；

步骤三：折纸探针的特异性标记；

步骤四：原子力显微镜下成像观察。

4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，步骤一中，按照Rothemund和Seeman的方法制备折纸，并使用100kDa超滤管离心除去多余的订书钉链或琼脂糖电泳纯化并利用Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns浓缩回收。

5.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，步骤二中，在延伸单链形成双链的过程利用Vent(exo^-)DNA聚合酶。

6.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，步骤三包括将过量DNA折纸探针与标记有特定双嵌段引物的目标DNA分子混合反应12小时以上。

7.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，步骤四包括将3μL的样品滴在新剥离云母片上，静置吸附约3分钟后利用氮气吹干于多模式8型AFM气相条件下观察。

8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，在步骤四中还包括舒展操作，即采用含有二价阳离子的1×TAE/Mg²⁺作为缓冲液，将样品在云母表明吸附一定时间后，利用水流的作用和阳离子缓冲液环境下的吸附力的平衡作用将目标DNA舒展开来。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在构建线性双链DNA的Lambda模型后，用折纸探针对其进行特异性标记前，需要对线性双链DNA进行处理，其处理过程如下：

(1)将目标线性双链DNA序列由双链变为单链，采用的是不对称修饰引物PCR的方法，设置长片段PCR程序扩增长片段目标序列，得到与目标单链互补的ssDNA且5’端磷酸化，在Lambda外切酶的作用下可以将5’端磷酸化的单链DNA消化掉，从而得到待检测的目标DNA；

(2)将相应的双嵌段引物和上游引物加入后，经过PCR退火和延伸，双嵌段引物可以特异性地与相应位点结合。