[发明专利]一种抗PEDV的单克隆抗体及其化学发光方法检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物监测领域，具体涉及一种抗PEDV的单克隆抗体及其化学发光方法检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻（PED）由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪只发生呕吐、腹泻、肠炎、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。所有不同阶段的猪群均可感染，发病率可达100%，哺乳仔猪的死亡率高达90%以上。在许多养猪业发达的国家都己有此病暴发的报道,尤其是在亚洲、欧洲等地区引起了重大的经济损失。

PED 首次在1971 年于英国报道，随后在1978 年该病在比利时和英国首次得到鉴定， 我国于1984 年证实该病在的存在，目前世界上大多数养猪国家都有该病的报道，尤其以韩国、日本、中国、泰国和越南等国家发病严重。自2010年秋以来,我国南方部分省份出现了严重的仔猪流行性腹泻,发病情况比先前更为凶猛，造成仔大量的哺乳仔猪发病死亡，尤其是7日龄以内的仔猪死亡率高达100%，给养殖户造成了巨大的经济损失，并已成为影响我国养猪业健康发展的重要疫病之一。由于PED与猪传染性胃肠炎(TGE)在流行病学、临床症状等变化上非常相似这给该病的快速诊断与防治都带来了一定困难。另外，由于PEDV具有在体外分离培养难度大的特点，在研制单克隆抗体方面大多通过原核表达病毒的某个蛋白，制备抗相应蛋白的单克隆抗体，而通过PEDV疫苗弱毒株，研制出抗PEDV的IgG2a单克隆抗体，并利用单克隆抗体，建立化学方法检测PEDV方法，未见报道。因此，本研究利用空斑纯化技术，从猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-轮状病毒的三联弱毒疫苗中获得PEDV弱毒株，作为抗原，制备PEDV单克隆抗体，并建立化学发光检测技术及应用于该病的诊断，对该病的有效诊断与防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗PEDV的单克隆抗体及其化学发光方法检测方法，主要利用空斑纯化技术，从猪流行性腹泻病毒-猪传染性胃肠炎-猪轮状病毒的三联活疫苗中纯化获得PEDV弱毒，通过细胞培养、梯度离心、免疫小白鼠和制备单克隆抗体核心技术，获得抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株及PEDV IgG2a单克隆抗体，单克隆抗体具有效价高、特异性强及稳定性好等特点。利用PEDV单克隆抗体，通过包被液、单抗包被浓度等系列条件优化，建立了一种检测PEDV的化学发光检测方法。该方法具有特异性强、敏感性高、一次性检测量大及稳定性好等特点,能检测到0.26ng的病毒。建立的化学发光检测方法，应用表明与RT-PCR检测技术的符合率在95%以上，与荧光定量RT-PCR检测方法符合率100%，适合对PEDV的快速诊断。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用所述PEDV单克隆抗体建立检测PEDV的化学发光检测方法，具体包括如下步骤：

（1）抗体包被：采用磷酸盐缓冲液为包被液，以4ug/ml PEDV单克隆抗体浓度包被于固相载体微孔板上，100ul/孔，37℃孵育2h或4℃过夜，洗涤3次；

（2）封闭：以2.5%BSA作为封闭液体封闭覆盖微孔板，每孔300ul/孔，4℃过夜，洗板3次；

（3）加样：依次加入样品，100ul/孔37℃温育1小时，洗板3次；

（4）加酶标二抗：加入HRP酶标记的PEDV单克隆抗体，以1:4000稀释后的液体加100ul/孔，37℃ 45min，洗板6次；

（5）加检测底物：加入化学发光底物液Thermo Scientific SuperSignal ELISA Femto底物液（购自ThermoFisher）100ul/孔，避光反应3分钟；

（6）检测：用发光检测仪测定发光计数。

HRP酶标记PEDV单克隆抗体的方法通过常规方法标记获得。

本发明的优点在于：