[发明专利]一种共发酵葡萄糖和木糖生产L-乳酸的乳酸片球菌构建方法

说明书

本发明公开了一种共发酵葡萄糖和木糖生产L‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，属于基因工程技术领域。构建步骤包括，利用热敏型敲除系统在L‑乳酸生产菌株乳酸片球菌Pediococcusacidilactici TY112(保藏号为CGMCC NO.8664)基因组上整合异源木糖异构酶，木酮糖激酶，转酮醇酶以及转醛醇酶编码基因；敲除磷酸转酮酶和乙酸激酶编码基因；适应性进化提高共发酵葡萄糖和木糖的能力。本发明成功得到了一株高效共发酵葡萄糖和木糖生产光学纯L‑乳酸的工程菌株，并命名为P.acidilactici ZY271，其保藏号为CGMCC NO.13611。

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种基于同源重组原理，利用热敏型敲除系统的共发酵葡萄糖和木糖生产L-乳酸的乳酸片球菌构建方法。

背景技术

乳酸是一种重要的工业化学品，它广泛运用于食品、医药、皮革以及纺织业。近年来，以光学纯L-乳酸为前体生产生物可降解性塑料聚乳酸，使得光学纯L-乳酸的需求大大提升。目前，乳酸生产主要包括两种路径：化学合成和微生物发酵。化学合成主要缺点在于其生产的乳酸是D/L混合型乳酸，而微生物发酵优点在于可生产光学纯乳酸、低的生产温度以及低能耗，使得微生物发酵成为主要的乳酸生产方式。世界上90%的商用L-乳酸都是由玉米淀粉类原料进行发酵得到的，而玉米淀粉原料的成本约占总发酵成本的70%。因此，亟需找到一种廉价的原料替代淀粉类原料进行L-乳酸生产。木质纤维素原料是一种价格低廉、来源广泛的可再生生物质能源，利用廉价、含量丰富的木质纤维素原料将会大大减少L-乳酸生产成本。

木质纤维素主要包括纤维素（30-60%干重）、半纤维素（20-40%）和木质素（15-25%）。其中纤维素来源的葡萄糖可以被微生物利用。半纤维来源的木糖约占木质纤维素来源总糖的30%，但大部分生物炼制菌株都不能利用木糖，木糖的不可利用是木质纤维素原料进行高指标生物基化学品生产的一个重要难点。本实验室先前工作中，从玉米秸秆乙醇发酵醪中筛选得到一株乳酸片球菌P. acidilatici DQ2，该菌可以很好的适应木质纤维素体系，并可以利用玉米秸秆原料获得103g/L的D/L混合型乳酸。之后通过基因工程改造敲除了P. acidilatici DQ2基因组上D-乳酸脱氢酶基因ldhD，得到的工程菌株P. acidilaticiTY112可以利用30%（w/w）固含量的玉米秸秆原料产生104.5 g/L的光学纯L-乳酸，但其不能利用木糖。如果将木糖代谢路径构建至P. acidilatici TY112中，共发酵玉米秸秆中的葡萄糖和木糖，L-乳酸的产量必将大大提高。

据文献报道，乳酸菌中木糖代谢路径构建以生产L-乳酸只在Lactococcus lactis中实现过。Shinkawa等（Shinkawa S, Okano K, Yoshida S, Tanaka T, Ogino C, FukudaH, Kondo A. Improved homo L-lactic acid fermentation from xylose byabolishment of the phosphoketolase pathway and enhancement of the pentosephosphate pathway in genetically modified xylose-assimilating Lactococcuslactis. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91:1537-1544.）敲除了PK路径的磷酸转酮酶编码基因pkt，并将异源的转酮醇酶编码基因（tkt）整合至pkt基因位点处，并携带了xylRAB的表达质粒，得到的工程菌株可以通过PP路径利用木糖进行同型L-乳酸生产。但是该文献中的xylRAB是在质粒中进行表达的，并没有整合到基因组上，得到的工程菌株并不是一株稳定的工程菌株，在发酵过程中需要添加抗生素维持重组菌的正常生长，抗生素的添加将会增加发酵成本，对于大规模工业运用来说是一个重要缺陷。另外该文献及作者后期的研究中并没有使用木质纤维素原料进行共发酵生产L-乳酸，没有实际证明该工程菌株具备共发酵葡萄糖和木糖生产L-乳酸的能力。