[发明专利]一种共发酵葡萄糖和木糖生产L-乳酸的乳酸片球菌构建方法

权利要求书

1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产L-乳酸的乳酸片球菌Pediococcus acidilactici构建方法，步骤包括：

（1）木糖代谢在P. acidilacticiTY112中的实现：将携带木糖异构酶xylA和木酮糖激酶xylB的表达质粒pMG36e-PldhD_xylAB_2911电转化至P. acidilacticiTY112，其菌种保藏号为CGMCC NO.8664；得到的重组菌P. acidilactici TY112-pMG36e-PldhD_xylAB_2911可以利用木糖进行生长和L-乳酸生产，但同时产生了大量副产物乙酸；

（2）磷酸转酮酶路径（PK路径）的阻断：通过同源重组敲除P. acidilacticiTY112基因组上的磷酸转酮酶基因pkt，以阻断PK路径从而减少副产物乙酸生成，得到的工程菌株为P. acidilacticiTY112-Δpkt；

（3）戊糖磷酸路径（PP路径）的构建：在步骤（2）得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶基因tkt和转醛醇酶基因tal整合至步骤（2）中敲除的pkt基因位点处，使菌株通过PP路径代谢木糖，得到的工程菌株为P. acidilactici TY112-Δpkt::tkt_tal；

（4）xylAB的整合以及乙酸激酶ackA2的插入失活：在步骤（3）得到的菌株基础上，将步骤（1）中的xylAB表达框整合至乙酸激酶ackA2位点处，同时将ackA2进行插入失活，得到的工程菌株为P. acidilacticiTY112-Δpkt::tkt_tal-ΔackA2::xylAB；

（5）驯化加快木糖代谢：将步骤（4）得到的工程菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行驯化以提高木糖代谢能力；所述驯化方法是：将步骤（4）得到的工程菌株P. acidilactici TY112-Δpkt::tkt_tal-ΔackA2::xylAB在简化MRS培养基中培养12h后，以体积比为10%的接种量接种至以40g/L木糖为唯一碳源的MRS培养基中，之后，每24h以10%接种量转接至新鲜的木糖MRS培养基中进行发酵，直至细胞生长、发酵液中残留的木糖以及生成的L-乳酸稳定时停止驯化；其中，启动子PldhD是以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列从P. acidilacticiTY112基因组上扩增得到，基因xylAB_2911是以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列从P. acidilactici DSM20284基因组上扩增得到，基因tkt_tal是以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的引物序列从P. acidilacticiDSM20284基因组上扩增得到。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述驯化经过66天共计66次的连续转接，得到的木糖发酵性能稳定的驯化菌株命名为P. acidilactici ZY271，其保藏编号为CGMCC NO.13611。