[发明专利]环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测锦鲤疱疹病毒

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测锦鲤疱疹病毒。

背景技术

锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)于1998年5月在以色列首次发现，到1999年才确认其病原为锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus，KHV)，又称鲤疱疹病毒III型(CyHV-3)。该病随后在美国、印尼、英国、欧洲大陆、日本等地区都有大面积爆发。

KHV主要感染锦鲤、鲤鱼及其普通变种。潜伏感染KHV的鱼体并不表现出临床症状，水温适宜时会暴发和死亡。该病具有高度传染性和极强致死率，不仅可以水平传染，也会垂直传播。近年来给我国锦鲤、镜鲤、普通鲤鱼的养殖造成了巨大的经济损失。我国农业部、国家质量监督检验检疫总局联合公告第2013号公布的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》里将其列为二类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的疾病。因此，做好KHV的检测与监控工作是控制KHV传播的首要工作。锦鲤疱疹病毒早期检测是降低其流行风险、减少其发病导致巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适用于现场应用的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒显得尤为重要。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号WO00/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。

横向流动试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测无需特殊的设备，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液，并且不需有毒试剂，操作简便且更安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察。LFD试纸条上具有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度，且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。

发明内容

本发明一个目的是提供一种检测锦鲤疱疹病毒的环介导等温扩增成套引物。

本发明提供的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；

所述上游外引物的核苷酸序列为序列1；

所述下游外引物的核苷酸序列为序列2；

所述上游内引物的核苷酸序列为序列3；

所述下游内引物的核苷酸序列为序列4。

上述成套引物中，所述上游外引物、所述下游外引物、所述上游内引物和所述下游内引物的摩尔比为1:1:8:8；

或所述上游内引物或所述下游内引物生物素的5’端标记生物素。

本发明另一个目的是提供一种检测锦鲤疱疹病毒的环介导等温扩增试剂。

本发明提供的环介导等温扩增试剂，包括上述的成套引物、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶；

所述上游外引物和所述下游外引物的浓度均为0.2μmol/L；

所述上游内引物和所述下游内引物的浓度均为1.6μmol/L。

本发明第3个目的是提供一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂。

本发明提供的试剂，由上述的成套引物和探针组成；

所述探针的核苷酸序列为序列5，

或所述探针的5'端末端异硫氰酸荧光素FITC标记。

本发明第4个目的是提供一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒，包括上述的成套引物或上述的环介导等温扩增试剂或上述的试剂。

上述的成套引物或上述的环介导等温扩增试剂或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测锦鲤疱疹病毒中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述的成套引物或上述的环介导等温扩增试剂或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测锦鲤疱疹病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的成套引物或上述的环介导等温扩增试剂或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染锦鲤疱疹病毒中的应用也是本发明保护的范围；