[发明专利]一种M1病毒全长感染性克隆及制备方法及其在制备M1病毒中的应用

说明书

本发明公开了一种M1病毒全长感染性克隆及制备方法及其在制备M1病毒中的应用。所述的M1病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.6所示。该全长感染性克隆成功制备出M1病毒。本发明成功获得可用于制备各种重组M1病毒的M1病毒的反向遗传学系统‑全长感染性克隆，其在神经环路标记、肿瘤感染与消灭、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种M1病毒全长感染性克隆及制备方法及其在制备M1病毒中的应用。

背景技术

M1病毒属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可被切割成5个结构蛋白(C,E3,E2,6K和E1)和4个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。尽管该病毒发现已经有较为长远的历史，但是其与细胞的互作机制、病毒的复制机制等尚不清楚。病毒的反向遗传学系统包括：全长感染性克隆、复制子和病毒样颗粒等。这些系统对于充分了解病毒与宿主的互作机制、病毒的复制机制，以及改造病毒具有十分重要的意义。然而目前为止，尚无M1病毒的反向遗传学系统，从而限制了相关的研究。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过一系列方法建立病毒的反向遗传学系统，并进一步来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了M1病毒全长感染性克隆。将在神经环路标记、感染与消灭肿瘤细胞、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制的分析、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种M1病毒的全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO：6所示。

本发明的目的在于提供了一种M1病毒全长感染性克隆的制备方法，方法简单，易行。

本发明的目的在于提供了一种M1病毒全长感染性克隆应用，该全长感染性克隆可用于制备M1病毒，制备的M1病毒可应用于脑科学研究、感染肿瘤细胞并杀灭、药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

M1病毒全长感染性克隆的构建：

分别采用酶切和同源重组的方法将M1病毒基因组四个片段F1(SEQ ID NO:1)、F2(SEQ ID NO:2)、F3(SEQ ID NO:3)和F4(SEQ ID NO:4)顺次插入载体F5(SEQ ID NO:5)的PacI和RsrII酶切位点之间，获得的测序正确的克隆命名为M1-F1-F2-F3-F4,即为M1病毒的全长感染性克隆pFLM1，其序列为SEQ ID NO.6所示。

M1病毒的制备：

1.将全长感染性克隆pFLM1转染BHK21细胞培养，在不同时间收集病毒上清；

2.用MluI酶切pFLM1，回收被酶切的产物，使用MEGAscript T7Transcription Kit体外转录酶切后的pFLM1成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过显微镜观察实验组和对照组的细胞状态。

以上方法制得的M1病毒可应用于脑科学研究、感染肿瘤细胞并杀灭、药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：