[发明专利]一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人细胞角蛋白7的试剂盒

说明书

本发明为一种一步法实时荧光定量RT‑PCR检测人细胞角蛋白7 试剂盒，该试剂盒以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免了交叉污染，并可以精确定量检测标本中人细胞角蛋白7(CK7) 的mRNA表达量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测患者外周血、淋巴结等标本中CK7的表达，用以辅助诊断、指导治疗结直肠癌及提示预后。

技术领域

本发明属生物技术领域，为一种通过以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行的检测技术，可以精确定量检测标本中人细胞角蛋白7 (CK7) 的mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

上世纪中期，随着人们生存居住环境、饮食习惯以及生活水平的不断改变、不断提高，与此同时各类肿瘤的发病率/死亡率也呈逐年上升趋势。结直肠癌的发病率和死亡率仅次于肺癌和乳腺癌，已成为第三恶性肿瘤。结直肠癌具有高度恶性与侵袭性的生物学特性，常发生浸润、转移，此生物学特性是导致患者预后较差及死亡率较高的一个重要因素。结直肠癌的发生、发展是与多基因相关、多因素相互影响、多步骤、错综复杂循序渐进的过程；然而其诊治关键要点与大多数肿瘤一样，在于早期发现、早期诊断、早期治疗。临床研究表明，早期结直肠癌的手术治愈率可以达到 80%-90%，然而结直肠癌患者常常因早期缺乏特异性的临床症状与体征，不易引起患者足够的重视，难以在患病早期及时的发现并行手术治疗。多数结直肠癌患者在发现时已是中期，甚至是晚期，即使行手术治疗，也难以达到患者理想的效果，术后复发转移率较高，生存期也较短，预后不佳。近几年，以消化道内镜结合病理学检查为主的诊断方法在临床上广泛应用，但是针对我国目前医疗现状来说，暂不适合大规模消化内窥镜筛查，进而导致早期行手术治疗率较低。临床发现中晚期结直肠癌患者即使进行手术治疗，也有 30%-40%的患者术后出现复发或转移播散，复发和转移目前导致结直肠癌患者死亡最主要原因之一。近年来，结直肠癌治疗及手术方案有了明显的改善与进步，同时各种后期治疗手段如：放、化疗在不断更新与完善，生物治疗、基因治疗等新方法不断涌现。血循环中存活的肿瘤细胞是远处转移和复发的基础，尽管各种结直肠癌的各种检测方法不断的增多，然而这一类细胞数量极微，不易被临床常规手段检测出来。近年来，通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术检测外周血中微量循环肿瘤细胞(Circulatingtumor cell，CTC) 已成为可能并被尝试。

角蛋白 (CK) 是一种丝蛋白，存在于上皮细胞间，具有保持上皮细胞和组织机械稳定性和完整性的作用。研究发现，正常组织细胞上皮及癌细胞中均存在角蛋白，而在健康人外周血液中却没有发现角蛋白的踪影，但是肿瘤患者的外周血液中则存在角蛋白。细胞角蛋白7 (CK7) 可以作为结肠癌、肝癌等肿瘤细胞转移的鉴别因子也可以作为诊断结直肠癌是否发生转移的诊断指标。因此检测患者外周血和淋巴结等标本中有无CK7 mRNA的表达，可以对上皮类来源的结直肠癌肿瘤的转移诊断和治疗提供有力证据，还可以对肿瘤的转移和复发情况以及疗效观察提供帮助。一步法荧光定量PCR技术使反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。具有方便、便捷、重复性好等特点。

发明内容

本发明试剂盒包含：逆转录聚合酶链反应液 (RT-PCR反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆转录酶、RNA酶抑制剂 (Rnasin)、耐热性DNA聚合酶 (Taq DNA聚合酶)、标准品、阴阳性对照品。

其中逆转录聚合酶链反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、逆转录聚合酶链缓冲液、寡聚(dT)15-18(Oligo(dT)_15-18)、dNTPs、MgCl₂、检测用上下游引物、荧光探针。

检测用引物分检测用上游引物和检测用下游引物：

上游引物序列为：5’—ACCAGTTCGCCATGGATGAC—3’，

下游引物序列为：5’—GATCTGGGTCATCTTTTCACGG—3’，