[发明专利]一种利用酶切技术鉴定大骨鸡品种的方法及PCR扩增专用引物对

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及利用酶切方法特异性鉴定中国地方鸡品种。

背景技术

大骨鸡又称庄河鸡，是以蛋大为突出特点的兼用型地方鸡种，其体大墩实，觅食力强，产蛋多而大，且蛋壳厚而坚实，肉质鲜嫩等特性。大骨鸡曾与蒙古马、秦川牛、长白猪并列中国农业的四大品牌，在国家级禽资源保护品种名录里，位列11个鸡种的第二位。大骨鸡的饲养周期长，只能散养，成本比较高，风险比较大，一般企业和养殖户不愿染指，致使庄河大骨鸡虽然美味但正宗品种数量较少，冒充的品种鸡肆虐市场。对于一些外观容易混淆的群体，利用分子检测技术可以更准确的给出鉴定结果。分子技术由于其操作简便、快速高效等特点，已在国外肉类掺假研究中得到广泛应用，并取得一些创新性成果。动物线粒体基因组DNA作为核外遗传物质，无论是在种间还是种内都具有广泛的多态性，是设计肉类成分定性检测的首选靶点，D-Loop区在线粒体基因组中属于进化速率较快的，更有利于不同品种的定性检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用酶切技术鉴定大骨鸡品种的方法及PCR扩增专用引物对，本发明操作简便、快速，检测结果准确的定性大骨鸡种类，该方法利用本实验室检测到的大骨鸡d-loop区SNP变异位点进行酶切对大骨鸡品种检测，所设计引物和酶切酶具有良好的特异性。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，利用酶切技术鉴定大骨鸡品种的PCR扩增专用引物对，PCR扩增专用引物对的核苷酸序列为：

所述引物对的上游引物序列为：5'CCACCTCACGAGAGATCAGC 3'，

所述引物对的下游引物序列为：5'GTGAGGGGAGTTAAGTGGCAT 3'。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，利用酶切技术鉴定大骨鸡品种的方法：利用所述PCR扩增专用引物对大骨鸡样本DNA和待测肉样DNA混合样本在相同条件下进行PCR扩增，然后用PCR产物进行酶切，最后采用2.5g/100ml琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，以大骨鸡样本DNA琼脂糖凝胶电泳图谱中两条电泳条带294bp，460bp为阳性结果；将待测肉样DNA混合样本酶切产物电泳图谱与阳性结果进行比对，如果待测肉样DNA混合样本酶切产物琼脂糖凝胶电泳图谱中出现两条电泳条带294bp，460bp则认定待测肉样DNA混合样本为纯正的大骨鸡品种；只有一条电泳条带754bp，为假大骨鸡品种。

优选的，PCR扩增反应体系为：2×PCR Mix 10μl，10mol/μl上游引物0.2μl，10mol/μl下游引物0.2μl，模板DNA 1μl，灭菌双蒸水8.6μl。

优选的，PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s此过程经过30个循环,最后72℃延伸5min。

优选的，酶切反应体系：10×Buffer 2μl，SnaⅠ酶4μl，PCR产物4μl，灭菌双蒸水10μl。

优选的，酶切反应程序：37℃45min(酶切)，80℃20min(灭活)。

利用所述PCR扩增专用引物对大骨鸡样本DNA和待测DNA混合样本同时进行同一PCR扩增和酶切，然后采用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，以大骨鸡样本DNA琼脂糖凝胶电泳图谱中两条电泳条带(294bp，460bp)为阳性结果；只有一条电泳条带(754bp)为阴性结果。将待测DNA酶切产物电泳图谱与阳性结果进行比对，如果待测DNA样本酶切产物琼脂糖凝胶电泳图谱中出现两条电泳条带(294bp，460bp)则认定为纯正的大骨鸡品种。

优选的，所述PCR扩增产物及酶切位点：