[发明专利]一种诱导酿酒酵母高产金属硫蛋白的方法及其应用有效
| 申请号： | 201710491189.2 | 申请日： | 2017-06-26 |
| 公开（公告）号： | CN107384996B | 公开（公告）日： | 2020-10-23 |
| 发明（设计）人： | 施明雨;孔祥平;李万波 | 申请（专利权）人： | 盘古基因生物工程(南京)股份有限公司 |
| 主分类号： | C12P21/02 | 分类号： | C12P21/02;C07K14/825;C12R1/865 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 李晓峰;徐冬涛 |
| 地址： | 210032 江苏省南京市浦口*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 诱导 酿酒 酵母 高产 金属 蛋白 方法 及其 应用 | ||
【说明书】：
本发明公开一种诱导酿酒酵母高产金属硫蛋白的方法及其应用，该方法为：向发酵培养基中添加复合诱导剂诱导金属硫蛋白生产菌发酵生产金属硫蛋白，所述的复合诱导剂包括Zn2+和Cu2+；诱导时，所述的Zn2+在发酵培养基中的含量为5～15mM；所述的Cu2+在发酵培养基中的含量为0.1～1.5mM。本发明公布了双离子复合组分诱导野生型酿酒酵母高产金属硫蛋白的方案；本工艺解决了利用锌离子诱导酵母源金属硫蛋白产量不足以及铜离子诱导存在毒性的问题，最终获得的酿酒酵母菌体经细胞破碎、纯化、冻干等后处理步骤在保健品和化妆品领域具有较高的应用价值。
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及到生物工程手段制备金属硫蛋白并应用于化妆品及保健品中。
背景技术
金属硫蛋白(metallothionein，MT)广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守，构象较坚固,具有较强的耐热性。MT的分子量约为2～7kD，富含半胱氨酸(20％～30％)、不含组氨酸和芳香族氨基酸，对多种重金属有高度亲和性，与其结合的金属主要是镉、铜和锌。本世纪初，有自由基清道夫之称的“金属硫蛋白(MT)”被广泛应用在尖端美容化妆品，用来阻止紫外线、电磁辐射、雾霾污染物、含重金属灰尘等对皮肤的伤害，减少自由基对皮肤组织细胞的侵袭，延缓机体老化，使皮肤组织保持在最佳状态。
根据MT在化妆品、保健品和新医药等三个领域的应用发展情况，结合我国消费者的实际水平，每年的需求量在数十公斤，然产量仅有10公斤左右，远远不能满足实际需求，供不应求的市场导致其价格高达300～1000万元/㎏(化妆品领域和医药领域)。我国现有1.2亿老年人和3.4亿儿童，全球范围内则更多，仅就老年儿童保健品，女性化妆品和生物药品来看，金属硫蛋白的市场前景非常广阔，每一个方面的应用在全球范围内都有上千亿美元市场空间，单国内就有数百亿元的市场潜力，所以其将来的市场潜力巨大。
中国科学院专家经过几年的努力研制出用猪肝生产金属硫蛋白技术，项目技术成果整体上居同类研究的国际先进水。然而，目前国内采用的都是用兔肝生产金属硫蛋白，设备投入大，转让费高，生产周期长，而且产量低。通过微生物基因工程改造，构建可外源表达金属硫蛋白的重组菌是一种潜在的高效生产方式，但由于金属硫蛋白利用分子生物学实现可溶性表达难度较大，同时外源表达体系自身带有的有害物质往往限制了其应用领域。
酵母是一种工人的安全性微生物，已被广泛的应用于食品和化妆品等领域。酵母抽提物是以食品用酵母为主要原料，以酵母自身的酶或外加食品级酶的共同作用下，酶解自溶(可再经分离提取)后得到的产品，并富含氨基酸、肽、多肽等酵母细胞中的营养成分。酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的淡黄色粉末。其中氨基酸含量30％以上，总蛋白50％以上，核苷酸10％以上，在化妆品中具有保湿、赋活等功效。氨基酸是皮肤角质层中自然保湿因子(NMF)的主要成分，易被皮肤吸收，使老化的表皮恢复弹性，延缓皮肤衰老。核酸及核苷酸是人体的主要遗传物质，具有促进新陈代谢、提高蛋白质合成速度等作用，增强免疫机能、增强SOD活性，提高皮肤抗自由基能力。此外，产品中少量的维生素和矿物质等营养元素还可以为皮肤提供充足的营养。
因此，开发以发酵酵母法制备富含金属硫蛋白的酵母产品具有重要的市场价值。目前高产MT的酵母菌株主要通过金属离子诱导获得。其中，锌是一种无毒的诱导剂，但其诱导作用较弱，最终获得的酵母菌体中MT含量非常低，采用铜和铬诱导酵母虽然MT含量可显著提高，但其附带的重金属又限制了其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于诱导金属硫蛋白生产菌高产金属硫蛋白的复合诱导剂及其应用。
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- 本发明涉及生物提取领域，特别涉及一种小球藻多肽及其制备方法，其中，一种小球藻多肽的制备方法，将小球藻干粉与纯化水混匀得到的小球藻混悬液依次经破壁提取、离心静置除杂、酶解及分离纯化得到小球藻多肽；酶解为向离心静置除杂得到的小球藻水提液，加入中性蛋白酶进行水解；分离纯化为将经灭酶活的中性蛋白酶水解液，离心、过滤取上清液截留分子量3000Da的小球藻蛋白酶解液，再经200Da纳滤膜除杂，浓缩、干燥得到小球藻多肽。该制备方法通过中性蛋白酶进行水解得到的小球藻多肽对脂肪酶的抑制活性高，具有降脂的作用；本制备方法采用破壁提取、酶解，结合膜过滤纯化，适合工业化生产。
- 一种脂多糖在特异性诱导细胞产生IL24中的应用-202310085936.8
- 谢文强;邵龙泉;廖媛;倪佳 - 南方医科大学口腔医院
- 2023-01-18 - 2023-06-23 - C12P21/02
- 本发明属于诱导表达技术领域，公开了一种脂多糖在特异性诱导细胞产生IL24中的应用。本发明将脂多糖在特异性诱导细胞产生IL24中应用。本发明发现牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的脂多糖(LPS)可以特异性诱导成纤维细胞产生IL24。相较于现有技术中可以诱导细胞产生IL24的IL‑1β、IL17A等细胞因子，P.g‑LPS获取更简单，成本更低。本发明为通过诱导IL24治疗肿瘤疾病提供了新的思路。
- 使用部分收获的芽孢杆菌工业发酵工艺-202180059541.X
- A·道布;A·戈拉布吉尔安巴拉尼;T·克莱因;M·莫尔韦泽;G·B·旺德利 - 巴斯夫欧洲公司
- 2021-07-27 - 2023-06-23 - C12P21/02
- 本发明涉及工业发酵领域。特别涉及从芽孢杆菌属宿主细胞生产感兴趣的蛋白质的方法，包括以下步骤：用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，所述芽孢杆菌属宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体，在有利于所述芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下，在所述发酵培养基中培养所述芽孢杆菌属宿主细胞的培养阶段，其中，在所述培养阶段期间的所述芽孢杆菌属宿主细胞的培养包括加入至少一种进料溶液并且其中所述至少一种进料溶液提供碳源，以及在所述培养阶段期间的不同时间点从所述芽孢杆菌属宿主细胞培养物中分离部分并从所述部分获得感兴趣的蛋白质。
- 一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法-201910849868.1
- 王昂;仲伟潭;郭月玲;张莉;张雪霞;高健;石英;米贯东;王崔岩;常亮;李敏;安兰兰;彭亮;谢新宇 - 华北制药集团新药研究开发有限责任公司
- 2019-09-10 - 2023-06-13 - C12P21/02
- 本发明公开了一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，包括发酵配方及补料发酵工艺。发酵配方分为由发酵碳源及无机盐组成的基础配方和由发酵氮源组成的补料配方。补料发酵工艺，包括以下部分：a）发酵罐单消灭菌，b）补料瓶单消灭菌，c)在发酵的前中期，匀速补入由发酵氮源组成的补料液。通过本方法进行发酵培养得到的硫酸多粘菌素B，发酵效价平均可达11000u/mL以上，比原发酵水平提高了30%以上，且发酵液组分比例接近标准品液相图谱，易于工业化生产。
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