[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核 酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法。

背景技术

近年来，食源性致病菌引发的食品安全事件频发，相应的检测技 术要求也逐渐严格。传统的检测技术主要依赖于平板培养以及生理生 化鉴定，对于一些难以培养的菌株而言，容易产生检测的假阴性。近 年来兴起的快速检测技术有酶联免疫技术、PCR及定量PCR技术、等 温扩增技术、传感器技术等，综合比较，传感器技术在现场快速检测 中因其高灵敏度和便携性而占有更大的优势。

随着技术的发展，各种各样的传感器都应用于致病菌的检测，例 如光学传感器、电化学传感器、晶体传感器等。大部分传感器都具有 很好的检测性能，但因为检测成本的原因不能在现场进行推广。相比 之下，核酸层析生物传感器的优势就体现出来：成本低、易合成、稳 定性好等，使之成为致病菌快速检测领域的一股新流。

识别元件是核酸层析生物传感器的一个重要部件。传统的信号识 别通过抗原抗体之间的免疫亲和实现，但是抗体的成本高且稳定性 差，不适合推广应用。近年来核酸杂交逐渐应用到信号识别中，体现 出良好的灵敏度和稳定性。肽核酸是一种人工核酸，能够与核酸之间 发生碱基配对，且稳定性更高，因此，将肽核酸应用在核酸传感器的 识别元件中，将会显著提高检测的灵敏度和稳定性。

为了提高检测的灵敏度，信号的放大至关重要，通过分子扩增技 术能够有效实现原始信号的放大。一般用到的预扩增技术有PCR技 术、LAMP技术、RPA技术等，考虑到现场检测的时效性，RPA技术 最能满足检测需求。RPA技术是一种重组聚合酶扩增技术，能够在短 时间内实现产物的累积，但是产物是双链核酸，无法用单链核酸试纸 条进行可视化检测。为了提高RPA技术的实用性，将通用接头及核酸 阻断技术引入到RPA技术中，建立一种新型的通用接头阻断重组聚合 酶扩增技术，能够得到带有单链接头的扩增产物，利用单链试纸条实 现可视化检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测食源 性致病菌的方法。

本发明构思如下：通过建立一种功能核酸全程控制的便携、简单、 封闭式的生物传感器，用于实现食源性致病菌的现场快超灵敏检测。 将通用接头阻断技术应用在RPA技术中实现双链产物向单链产物的 转化，同时也能推广应用到其他的双链分子扩增技术中，拓展了分子 扩增技术的应用范围。本发明构建的基于肽核酸的单链核酸层析试纸 条，能够高效捕获单链核酸，提高检测灵敏度和稳定性，实现可视化 检测。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于构建RPA生物传 感器的通用阻断接头序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种基于肽核酸的核酸层析试纸条，所述试纸条的 制备方法包括以下步骤：

1)纳米金颗粒的制备；

2)肽核酸探针的制备：人工合成质控捕获探针CCP、检测捕获 探针TCP和连接探针P，它们的序列分别为：

质控捕获探针CCP：5’-biotin-TGGTGGTGCTGGTT-3’

检测捕获探针TCP：5’-biotin-AACCAGCACCACCA-3’

连接探针P：5’-Cys-AACCAGCACCACCA-Glu-Glu-Glu-3’

3)纳米金修饰的连接探针P的制备；

4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品 垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设 有至少1条检测线和1条质控线；

①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述 缓冲液为：0.25-0.5％Triton X-100，0.1-0.2M硼酸盐缓冲液，0.15 -0.3M NaCl，pH 8.0；其中，所述结合垫上固定有纳米金修饰的连接 探针P；

②将30-50μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30-50μL的100μM肽 核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1-2h，分别制备出链 霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝 酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12-14h；

③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜 以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。

步骤1)中利用柠檬酸钠烧金法制备粒径为13nm的纳米金颗粒。