[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

权利要求书

1.一种基于肽核酸的核酸层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)纳米金颗粒的制备；

2)肽核酸探针的制备：人工合成质控捕获探针CCP、检测捕获探针TCP和连接探针P，它们的序列分别为：

质控捕获探针CCP：5’-biotin-TGGTGGTGCTGGTT-3’

检测捕获探针TCP：5’-biotin-AACCAGCACCACCA-3’

连接探针P：5’-Cys-AACCAGCACCACCA-Glu-Glu-Glu-3’

3)纳米金修饰的连接探针P的制备；

4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；

①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述缓冲液为：0.25-0.5％Triton X-100，0.1-0.2M硼酸盐缓冲液，0.15-0.3M NaCl，pH 8.0；其中，所述结合垫上固定有纳米金修饰的连接探针P；

②将30-50μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30-50μL的100μM肽核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1-2h，分别制备出链霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12-14h；

③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，步骤1)中利用柠檬酸钠烧金法制备粒径为13nm的纳米金颗粒。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，步骤3)具体为：将5-10μM步骤2)的连接探针P与10-20nM步骤1)的纳米金颗粒在5mM磷酸缓冲液中反应12-14h，然后14000rpm离心20-30分钟，收集沉淀物，再用5mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10mM的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针P。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，步骤3)具体为：将5μM步骤2)的连接探针P与10nM步骤1)的纳米金颗粒在5mM磷酸缓冲液中反应12h，然后14000rpm离心20分钟，收集沉淀物，再用5mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10mM的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针P；

步骤4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：

①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述缓冲液为：0.25％Triton X-100，0.1M硼酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH 8.0；

②将30μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30μL的100μM肽核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1h，分别制备出链霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12h；

③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。

5.基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计RPA引物RPA-UF和RPA-UR；

S2、提取待测样品DNA，以DNA为模板，利用步骤S1的RPA引物RPA-UF和RPA-UR进行RPA扩增反应；

S3、将步骤S2的RPA扩增产物与分析缓冲液混合，滴加到权利要求1-4任一项所述试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果:阴性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均显色；失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效；

其中，步骤S1具体为：以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计RPA扩增引物RPA-F、RPA-R，将通用阻断接头和至少1个C3阻断子顺次连接到引物RPA-F、RPA-R的5’端，得到用于通用接头阻断RPA扩增技术的引物RPA-UF、RPA-UR；其中，所述通用阻断接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

步骤S3所述分析缓冲液为：4×SSC，2％BSA，0.05％Tween-20，pH 7.0。