[发明专利]石莼活性多肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及石莼活性多肽的制备方法。

背景技术

石莼属绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属，其藻体呈黄绿色，有两层细胞组成的膜状体，边缘宽可达厘米左右。石莼多生长在中、低潮带的岩石上或石沼中，南方种类颜色偏黄，北方种类颜色偏绿，藻体含有多种维生素、麦角固醇，以及酸及丙、丁、戊、十四、十六酸有机酸等。石莼是一种大型海藻，广泛分布于西太平洋沿海。其适温范围0-35℃，适盐范围15-35%，具有很强的生命力和再生力，生长极泼辣，在水质肥沃的内湾生长更为旺盛，是我国野生藻类中资源极为丰富的一种。它不仅藻体鲜艳、味道鲜美，而且富含许多营养物质，具有很高的经济价值。但其在海藻加工工业中的利用价值远不如褐藻和红藻，因而通常作为天然垃圾废弃堆积，造成严重的环境污染和资源浪费。

干石莼经过化学分析表明，主要成分有粗纤维、碳水化合物、蛋白质及灰分，并含有少量脂肪，石莼中还含有K、Na、Ca、Mg、Ni、Zn、Mo、Cu等多种微量元素。蛋白质含量较高，一般含量在17～26%之间，不同产地的石莼蛋白质含量不尽相同、另外季节等因素也会对孔石莼中的蛋白质含量产生一定的影响作用，石莼蛋白质中含有丰富的氨基酸，其中有8种为人体必需氨基酸。石莼功用始载于《本草拾遗》，日“石莼生南海，附石而生，似紫菜，色青”，主“味甘无毒，入水，利小便”，《本草纲目》中记载谓“出闽、浙者，大叶似菜”，故也名海青菜，有软坚散结、清热解毒、利水降脂等功效。药理研究表明，石莼在降血脂、降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化以及克生作用等多方面都显现出了较强的生物活性。石莼可作海菜食用，有清口、解毒、消炎等功效，也可以用于防治中暑、消肿，治喉痛、肠胃炎，除口臭等。

现有技术如授权公告号为CN 102851345 B的中国发明专利，公开了小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，首先采用低温超高压连续流细胞破碎机提取小球藻蛋白，再用胰蛋白酶水解小球藻蛋白，超滤离心管过滤，获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的小球藻多肽。该方法制备的小球藻多肽对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用，但是制备周期长，小球藻多肽得率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性蛋白肽制备效率高、得率高、纯度高、能耗低、对环境友好的石莼活性多肽的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，具体包括以下步骤：

细胞破碎：将石莼粉按1:14-16料液比加水混匀，放入温度4-6℃、流速18-21mL/min、压力110-130MPa、循环2-3次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为40-50℃、功率为200-300W的超声波处理25-35min，然后经3-5℃、7000-9000rpm的低温离心机离心18-22min，即得蛋白提取液，该步骤结合细胞破碎仪与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；

盐析：向蛋白提取液中加入(NH₄)₂SO₄至20-25%饱和度，静止15-20min，继续加入(NH₄)₂SO₄至50-55%饱和度，静止15-20min，然后在3-5℃、4000-6000rpm下离心20-25min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗，且采用不同浓度的硫酸铵溶液，可缩短沉淀时间，效果良好；

透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddH₂O中透析，更换ddH₂O4-6次，袋内溶液冷冻干燥，即得石莼蛋白，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到除去(NH₄)₂SO₄小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；