[发明专利]一种黑曲霉的固定化方法

说明书

本发明公开了一种黑曲霉的固定化方法，把经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将黑曲霉活化后接入装有固定化培养基的发酵容器中培养，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。以聚酯纤维为固定化介质的气升式纤维床反应器生产柠檬酸，连续生产15批，产酸水平没有降低，发酵工艺稳定。最终柠檬酸产量88.65g/L,发酵速率1.06g/L/h，得率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)93.3％(w/w)。和游离发酵相比，固定化发酵的产量明显提高，发酵周期缩短，发酵液中的菌体量明显减少，粘稠度也随之降低，从而有利于后期的产物和菌体的分离。

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及黑曲霉的固定化方法。

背景技术

柠檬酸又名枸橼酸，化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是一种重要的有机酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。柠檬酸的物理性状一般为无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的性质。加热至175℃时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H⁺可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油的等能发生反应。柠檬酸在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、桃等果实中。柠檬酸的用途非常广泛，用于食品工业占生产量的75％以上，可做为食品的酸味剂，抗氧化剂，pH调节剂，用于清凉饮料、果酱、水果和糕点等食品中。用于医药工业占10％左右，主要用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等。用于化学工业等占15％左右，用作缓冲剂、络合剂、金属清洗剂、媒染剂、胶凝剂、调色剂等。在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中都有十分广阔的应用。

黑曲霉(Aspergillus niger)属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，纵梗孢科，曲霉属真菌中的常见种。黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37℃，对营养要求较低，容易培养。黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝处为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上面长有成串黑褐色的球状分生孢子。黑曲霉的菌落形态比较特殊，容易分辨和分离。黑曲霉可以生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶等酶制剂和柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等有机酸，是一种重要的发酵工业菌种。现在工业上一般采用液体发酵培养，但是由于黑曲霉在液体培养时菌量很大，造成发酵液过于粘稠，从而影响了发酵时营养物质的传递，同时对产物与菌体的分离也会造成不利的影响。

随着固定化技术的快速发展，现该技术已广泛应用于生物发酵领域。将丝状真菌菌丝体固定在谷梗或其他一些惰性材料上，或者采用海藻酸钠等载体材料包埋的方法，重复使用，既降低了发酵液粘度，利于氧气及营养物质的传递，提高了细胞利用率和生物反应速率，同时也便于产物的分离提取等后处理加工。近年来，丝状真菌的固定化发酵生产得到了越来越多的关注。

目前应用于黑曲霉的固定方法常见的有吸附法和包埋法，但是国内仍然以包埋法为主。王建龙等用质量分数为1.5％的海藻酸钠包埋一定量的孢子，于摇瓶中培养11天后，发酵液中柠檬酸产量达到40g/L，并经过了6批次连续重复发酵产酸稳定在较高水平。周剑平等采用聚乙烯醇凝胶载体固定黑曲霉的孢子，以初始糖浓度130g/L的玉米粉水解液为底物进行发酵，连续发酵8个周期后，柠檬酸产量可以保持稳定，始终保持在86～92g/L，产率达到70.7％。但是，包埋法所用到的凝胶颗粒机械性能很差，在搅拌发酵的时候很容易发生破碎，同时，包埋法仍然会对颗粒中心的菌体的氧气和营养物质的传递造成阻碍，因此对其柠檬酸的生产效率有了一定的限制。为了更进一步提高柠檬酸的生产效率，简化生产工艺，降低生产成本，仍需要寻找更加天然、高效的固定化材料。