[发明专利]一种一步逆转录RT‑qPCR人MTHFR与MTRR基因多态性表达的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，是一种体外诊断试剂，具体是指一种一步逆转录RT-qPCR人MTHFR与MTRR基因多态性表达的检测试剂盒。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，与甲硫氨酸合成酶还原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)一起，维持叶酸正常代谢。另外，MTHFR还参与维持体内正常的同型半胱氨酸水平。

体内MTHFR和MTRR基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症(HCY)。

对于MTHFR和MTRR基因异常的人，MTHFR和MTRR酶活性明显降低，造成叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸，以及用更长的周期补充叶酸才能达到预期的效果。

此外，MTHFR和MTRR基因异常易出现高同型半胱氨酸血症(HCY)，早期进行基因检测有利于预防高同型半胱氨酸血症(HCY)及心脑血管疾病。

因此，及时、准确地检测到人体MTHFR和MTRR基因异常对于指导备孕妇女如何有效补充叶酸，防止胎儿畸形，以及在人类预防HCY、心脑血管疾病等方面具有至关重要的意义。

目前，人体MTHFR与MTRR基因多态性和多态性表达的检测具有以下几种方法：1.DNA直接测序法；2.DNA-PCR-SSCP(聚合酶链式反应-单链构象多态性分析)；3.DNA-高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)；4.DNA-反向点杂交法；5.DNA-实时荧光PCR法；6.RNA-实时荧光PCR法。

1.DNA直接测序法

DNA直接测序法是进行叶酸代谢基因突变检测最直接最准确的方法，是检测未知的地贫突变基因的关键方法。但其需要对样品进行扩增、纯化、序列分析，所需的时间长，成本高，对取材和技术的要求都比较高，最重要的是限制灵敏度不高，对环境和操作者有危害。因此在临床应用上具有一定的限制。

2.DNA-PCR-SSCP(聚合酶链式反应-单链构象多态性分析)

PCR-SSCP是一种比较经典的基因突变检测方法，是一种定性检测基因突变的方法，可以对未知的突变进行检测。具有快速、简便、灵敏和经济的特点，受到广大研究者的青睐。但其也有一定的缺陷，电泳时间较长，操作步骤繁琐，只能进行定性分析，需要平行的标准对照。

3.DNA-高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)

利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列熔解曲线不同，在PCR后直接运行高分辨熔解进行样品突变分析，能够区分不同突变位点与不同基因型，但是HRM对仪器要求较高，受到仪器使用的限制。

4.DNA-反向点杂交法

反向点杂交法(RDB)是目前国内外最常用的技术，其优点在于一张杂交膜上可同时筛查多种点突变或者基因型，它的缺点也很明显，由于需要开盖进行后续处理，操作繁琐，实验时间长，实验室也很容易受到气溶胶的污染。

5.DNA-实时荧光PCR法

实时荧光PCR技术是在常规的PCR基础上加入了荧光标记探针或相应的荧光染料来实现定量或定性的功能。它摆脱了凝胶电泳技术，避免了有毒操作，操作简便。实时荧光PCR检测叶酸代谢基因突变，不需要检基因组DNA的具体含量，仅需检测样本是否具有信号即可，这使得整个过程更加简便，费用更低，而且PCR反应具有核酸扩增的高效性，即使只有微量的基因也可以检测出来，从而使它具有很高的灵敏度。

目前多数人MTHFR与MTRR基因多态性检测试剂采用实时荧光PCR法进行检测，具有灵敏度高和特异性好的优点。但是DNA-实时荧光PCR法针对的是MTHFR与MTRR的DNA序列，而不是针对发挥功能的RNA，并且DNA的合成产物不仅仅包括翻译区的外显子，还包括非编码区的内含子序列，因此该方法缺少检测的特异性。

6.RNA-实时荧光PCR法

RNA-实时荧光PCR法是针对RNA进行检测，目前针对基因组表达RNA的检测需要通过逆转录将RNA逆转录为cDNA,然后对cDNA进行实时荧光PCR检测。该操作方法繁琐，需要两步反应，同时需要对cDNA进行稀释后才能进行后续的实时荧光PCR反应，稀释过程容易产生气溶胶，造成实验室的大面积污染。

发明内容