[发明专利]一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术：

宫颈癌是全球女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌。2008年我国宫颈癌新发病例12.19/10万，位于女性新发恶性肿瘤第6位；宫颈癌死亡病例3.90/10万；我国的宫颈癌均呈现与发达国家相反的、明显的上升趋势。由于已有的研究证实了高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌发病密切相关，因此目前预防宫颈癌的发生一般都是通过检测女性是否感染了高危型的HPV病毒的角度来进行的。

2012年美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)制定的“宫颈癌预防及早期诊断筛查指南”指出：如HPV16或HPV16/18阳性则需立即转诊阴道镜检查。但临床证据表明，只有很少比例的女人感染高危型的HPV病毒后会发展到宫颈癌。HPV感染是一种极为常见的病毒感染，高达75％的女性在其一生中可能感染HPV；但这种感染是多数一过性的，可自行清除，只有持续性的高危型HPV感染才可能诱发宫颈癌前病变；并且即使HPV感染引发了子宫颈上皮内瘤变，真正发展到宫颈癌的机率也是很低的。因此就目前通过检测HPV病毒，甚至通过病理分析子宫颈上皮内瘤变来判断受检者患宫颈癌风险的方法，会导致临床的过度治疗，浪费大量的医疗资源。

因此，临床上急需能够即时、准确，并且费用能为患者所承受的精确宫颈癌早筛的技术出现。

基因甲基化是遗传表观学重要的组成部分。基因甲基化是肿瘤发生过程中的早期事件，是细胞的遗传本质和外界环境影响共同作用的结果。基因的启动子区域发生甲基化后，往往使得该基因的表达出现下调，随之影响了细胞内一系列的分子事件，最终导致细胞发生癌变。因此利用基因的甲基化来早期诊断肿瘤已经成为分子检验的一个热点领域；例如通过检测Septin9基因启动子区域的甲基化诊断试剂盒已经得到欧盟、美国FDA，以及中国FDA的批准，用于早期结直肠癌筛查。在宫颈癌筛查中，由于能直接收集到宫颈的上皮细胞，因此通过分析宫颈细胞中的甲基化程度来早期诊断宫颈癌，较其他内脏器官所发生的肿瘤，在临床上更容易操作。目前已经有众多研究报道通过全基因组方法来寻找在宫颈癌组织中发现甲基化，但在正常宫颈细胞中不发生甲基化的基因。

发明内容：

本发明的目的是提供一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用。

本发明最关键的构思在于：检测靶基因甲基化时，采取了双探针定量PCR的方法，即甲基化位点的CpG岛同时针对C碱基和U碱基设计探针(原理参考图1)，并采用甲基化值来评估样本中甲基化DNA所占的比例(甲基化程度)。有了甲基化值后，就方便确定阈值来自动化区分发生癌变和非癌变的临床样本。

甲基化值＝100/[1+2^(Ctm-Ctu)]，其中Ctm是甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值，Ctu是非甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值，若Ct值>45个循环，则默认为45。

本发明的第一个目的是提供一种宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK启动子甲基化程度的检测引物，所述的检测引物如下所示：

针对PAX1基因：

PAX1-F：5’-TTAGGGGGTAGTTGAGTAAGTT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

PAX1-R：5’-AAAATAACCTATAAATCCCCAAACAA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

针对FAM19A4基因：

FAM19A4-F：5’-TTTTAGTAGTAGTTTTAGGTTTT-3(如SEQ ID NO.3所示)’；

FAM19A4-R：5’-ATCCCTTCCAACCCTTCTTA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

针对PHACTR3基因：

PHACTR3-F：5’-GTTGGGGGAAGAGAGGTAGATT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

PHACTR3-R：5’-CTTCCAAAAACAAATACCCAAAC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

针对DAPK基因：

DAPK-F：5’-TTTTGGAGGTGGGAAAGTTG-3’(如SEQ ID NO.7所示)；

DAPK-R：5’-AAAAACACCCTTTATTAAAACTAAAC-3’(如SEQ ID NO.8所示)。