[发明专利]一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法

说明书

本发明涉及酶工程及生物医药技术领域，尤其涉及一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法。本发明筛选获得了一种能有效降解淫羊藿苷母核结构上鼠李糖残基的α‑L‑鼠李糖苷酶及能高效降解其母核结构中葡萄糖残基耐高温β‑葡萄糖苷酶，随后通过双酶转化高效制备具有完全保持原有生物活性的淫羊藿苷元。本发明提供的组合物中，两种糖苷酶的最适反应温度都较高，底物溶解性较好，不需要助溶剂；并且酶解时间短，得率高。实验表明，采用本发明提供的糖苷酶组合物对淫羊藿苷进行酶解，摩尔转化率为98.3％，淫羊藿苷元的得率为90％。

技术领域

本发明涉及酶工程及生物医药技术领域，尤其涉及一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法。

背景技术

淫羊藿苷元(Icaritin)为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体成分，具有雌激素样作用、调节免疫、促进心肌细胞再生和分化、促骨质保护、壮阳、抗肝损伤及延缓肝纤维化、抗肿瘤等多种药理活性。目前已经作为一类抗肝癌新药(阿可拉定)进入临床研究。淫羊藿苷元主要从中药淫羊藿中提取获得，但淫羊藿苷元在淫羊藿体内含量极低，分离提取工艺复杂，成本高。未来淫羊藿苷元的国际市场需求很大，因此高效环保地制备淫羊藿苷元的方法将受到广泛的关注。

淫羊藿苷是以淫羊藿苷元为母核，在淫羊藿中的含量很高，可以通过水解糖苷键制备淫羊藿苷元。目前淫羊藿苷元的制备方法主要以淫羊藿苷为原料采用酶法或酸法水解。如用复合纤维素酶或β-葡萄糖苷酶，酶解、酸解相结合，将淫羊藿苷转化为淫羊藿素，但是该酸解反应过程不好控制，副产物多，产品收率低，从而导致产品的成本较高；或通过一种商品化的β-葡萄糖苷酶将淫羊藿苷转化为淫羊藿苷元，虽然该酶能获得淫羊藿苷元，但是其水解时间长(24小时)，最高酶解收率也仅为55％左右，根据酶解效果及酶专一性特性，可知使用的β-葡萄糖苷酶来源于传统微生物发酵，其酶不是纯的β-葡萄糖苷酶；另有研究采用柚苷酶从淫羊藿苷获得淫羊藿苷元，将淫羊藿苷加入到30％～70％乙醇体系中，调节pH(4～8)，体系达到一定温度(40～70℃)，搅拌下控温反应30小时。但是柚苷酶是由微生物发酵制备的复合酶，专一特性主要为特异性水解柚皮苷，其中酶比例不可控、作用的先后顺序不可控，且反应时间长，效率低。可见，淫羊藿苷元的制备方法仍需进一步的改进。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法，本发明提供的糖苷酶组合物能够将淫羊藿苷转化为淫羊藿苷元，酶解时间短，得率高。

本发明提供了一种糖苷酶组合物，由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成；

所述α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF 3059、Aspergillus nigerNL-1或Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482；

所述β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH1家族、Thermotogathermarum DSM 5069 GH3家族、Thermotoga petrophila DSM 13995 GH1家族、Thermotogapetrophila DSM 13995 GH3家族或Aspergillus niger NL-1 GH3家族。

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40)，可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键，α-L-鼠李糖苷酶广泛存在于自然界的细菌和真菌中。β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。该酶在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现该酶的存在。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶，结构不同，催化特性也不尽相同。但它们在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。