[发明专利]一种检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测食管鳞癌相关基因 TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒。

背景技术

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是常见恶性肿瘤之一，其发病率在全球和中国分别排名第八和第四，全球每年有超过48万新发病例，造成约40万人死亡，其中一半发生在中国。目前食管癌治疗方法十分有限，5年生存率为15-25％(Chen,Zheng et al.2016)。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是亚洲最主要的食管癌类型(约90％)，全球约70％的ESCC病例发生在中国。ESCC 的发病机理目前尚不明确，吸烟、饮酒、饮食习惯和家族病史等被认为是最重要的影响因素，研究数据表明这些影响因素有明显的地域性差异，其中饮食习惯和家族病史对中国人的影响更大(Chen,Zheng et al.2016)。

目前对食管鳞癌的诊断仍局限在晚期阶段，且缺乏有效的早期诊断手段。近年来，随着分子诊断技术的进步，尤其是分子诊断技术在液体活检方面的广泛应用，大肠癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症的早期筛查技术取得了重大进展。现有分子检测对象多集中于基因突变，即基因序列或拷贝数变异，然而这类突变通常发生在较大的序列范围内，给检测工作带来诸多困难(Warton and Samimi 2015)。相比之下，以基因启动子异常甲基化作为肿瘤标志物具有独特优势，这类甲基化限定在启动子CpG岛中，检测范围较小，并且具有肿瘤特异性，能够在发病早期就被检测到，因此具有巨大的开发价值。目前，基于检测SEPT9启动子甲基化程度的商业化大肠癌检测试剂盒已获美国 FDA批准应用于临床，但食管鳞癌相关基因甲基化检测领域尚无相应产品问世。

目前，已有多个研究机构发表食管鳞癌甲基化检测靶标基因的相关报道，这些靶标基因包括TFPI2(tissue factor pathway inhibitor) 和HSPB2(heat shock protein B2)。TFPI2在多种肿瘤中表达下调，是一个潜在的抑癌基因，研究表明TFPI2启动子的特定CpG位点在早期食管鳞癌中的甲基化频率为67％，并且与肿瘤进展正相关(Jia, Yang et al.2012)。HSPB2是热激蛋白家族成员，它在早期食管鳞癌中的甲基化频率为95.7％(Chang,Yamashita et al.2011)。这些都为食管鳞癌辅助检测提供了理论基础，但目前国内外尚无TFPI2和HSPB2 启动子甲基化检测试剂盒及其在食管鳞癌辅助检测方面的报道。

发明内容

本发明旨在填补食管鳞癌相关基因甲基化检测试剂盒的空白，提供一种灵敏度高、特异性好、准确率高和操作简单的可用于检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的检测试剂盒，这两种基因启动子特定CpG位点的甲基化频率与食管鳞癌的患病率呈正相关，可以通过此检测辅助诊断食管鳞癌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种可用于检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，包括TFPI2和HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物、反向引物及其非甲基化特异性扩增正向引物和反向引物，其中所述的TFPI2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGGTCGGACGTTCGTTTCGTATAAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-GAACGACCCGCTAAACAAAACGT-3’(SEQ ID NO.2)；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

5’-TTGGTTGGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3’(SEQ ID NO.3)；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-AAACAACCCACTAAACAAAACATC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGTGTAAATCGTTTGTGAGGGTTTTAGC-3’(SEQ ID NO.5)；