[发明专利]一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法

说明书

一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，属于微生物检测领域，它的步骤包括膜过滤采集总菌、叠氮化钠处理采集到的总菌和环介导等温基因扩增测定；所述活的副溶血性弧菌包括可培养状态和非可培养状态。本发明采用价格低廉、易于获得的叠氮化钠预处理死菌中的DNA和胞外DNA，使它们失去扩增活性，进而通过基因扩增实现选择性检测活的副溶血性弧菌；操作过程中无需特定光源设备和其它贵重仪器，操作简易，成本低。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌(包括可培养状态和非可培养状态)的方法。

背景技术

副溶血性弧菌为革兰氏阴性菌，具有嗜盐、耐热特征，主要存在于海洋、河口环境及鱼、虾、贝等生物体中，是沿海地区主要食源性病原菌之一。从人类健康安全的角度出发，对水产品污染的可能性进行准确判断异常重要。到目前为止，多种分析检测方法得到了研究与应用，比如传统的培养法、免疫法，以及基于遗传物质信息的分子生物学方法——生物传感器法、聚合酶链式反应(PCR)法、环介导等温基因扩增法等，近年来都得到了迅猛的发展。特别是基于环介导等温基因扩增的各种方法(Yamazaki W,Yuko K,RyokoU,etal.Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid andsimpledetection of Vibrio parahaemolyticus in naturally contaminated seafoodsamples.Food Microbiology,2011,28,1238；Zeng J,Wei H,Zhang L,et al.Rapiddetection of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters using immunomagneticseparation combined with loop-mediated isothermal amplification.InternationalJournal of Food Microbiology,2014,174,123；Wang Y,Li DX,Wang Y,et al.Rapid andsensitive detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus bymultiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermalamplification technique.Molecules,2016,21,111；Wang R,Xiao XN,Chen Y,et al.Aloop-mediated,isothermal amplification-basedmethod for visual detection ofVibrio parahaemolyticus within only 1h,from shrimp sampling toresults.Analytical Methods,2017,9,1695)，较之于PCR法具有更高的灵敏度(最低可以检测出1个拷贝的基因)和特异性，而且生化反应对模板溶液中的血浆、细胞残渣等干扰物质耐受能力强(Zhang X,Lowe SB,Gooding JJ.Brief review of monitoring methodsfor loop-mediated isothermalamplification(LAMP).BiosensorBioelectronics,2014,61,491)，是近期研究热点之一。然而，大多基于环介导等温基因扩增的检测方法，只能用于诊断被检测样品中是否存在目标微生物标识基因，不能有效确定该基因是否来自于活性(包括可培养状态和非可培养状态)副溶血性弧菌。